Conséquences biochimiques et fonctionnelles de l'oligomérisation de la protéine kinase DLK par la transglutaminase de type II

L'apoptose est un processus de mort cellulaire génétiquement programmée se produisant lors de la différenciation et du développement normal des organismes multicellulaires. Les aberrations de la régulation de ce processus sont associées à l'apparition de divers désordres pathologiques. Un effecteur important de l'apoptose est la transglutaminase de type II (TG2), une enzyme Ca[exposant 2+]-dépendante catalysant la formation de liens covalents entre les résidus glutamines et lysines d'une même protéine ou de protéines différentes. Les mécanismes moléculaires par lesquels la TG2 favorise ou empêche l'apoptose sont mal définis, mais semblent impliquer des protéines intracellulaires spécifiques régulatrices de la mort des cellules. L'activation de la TG2 dans des cellules traitées avec le calphostin C, un inducteur d'apoptose, provoque la polymérisation (oligomérisation) de la protéine Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK), une composante importante de la cascade de signalisation de la kinase de stress c-jun N-terminal protein kinase (JNK). Cette cascade est reconnue pour son rôle dans de nombreux processus cellulaires. Ce travail a eu pour principal objectif de définir les conséquences de l'oligomérisation de DLK sur ses propriétés biochimiques et sur ses fonctions, particulièrement dans la régulation de l'apoptose. Dans une première publication, nous avons investigué les effets de l'oligomérisation de DLK, médiée par la TG2, sur l'apoptose. Nos résultats ont indiqué que, dans les cellules entrant en apoptose induite par le calphostin C, l'oligomérisation de DLK prenait place dans les phases précoces de la réponse apoptotique. La formation de l'oligomère augmente l'activité catalytique de DLK de façon significative, ainsi que son habileté à activer la voie de JNK. Fait important, nous avons aussi mis en évidence que l'oligomérisation de DLK facilitait l'entrée des cellules en apoptose, alors que l'oligomérisation d'un mutant inactif pour l'activité kinase de DLK ne produit pas cet effet. Dans une seconde publication, nous voulions déterminer le rôle de la TG2, de DLK et de JNK dans la réponse apoptotique induite par le calphostin C. Nos expérimentations ont révélé que l'apoptose induite par le calphostin C était clairement et majoritairement médiée par la voie de signalisation de JNK et menait à une mort cellulaire caspases-dépendante. La diminution d'expression de la TG2 ou de DLK par ARN interférent réduisait l'action du calphostin C sur l'activation de JNK et sur l'apoptose, alors que la diminution d'expression des deux protéines simultanément inhibait complètement ces phénomènes. Finalement, nous avons mis en évidence que la diminution d'expression de la TG2 bloquait complètement l'oligomérisation de DLK, confirmant le rôle crucial joué par TG2 dans la réponse apoptotique induite par le calphostin C. Ces résultats supposent que suite au traitement des cellules avec le calphostin C, l'activation de la TG2 mène à l'oligomérisation et à l'activation de la protéine kinase DLK. Cet oligomère constitutivement actif stimule de façon continue la kinase de stress JNK, facilitant ainsi l'entrée des cellules en apoptose d'une manière caspases-dépendante

The mitogen-activated protein kinase kinase kinase dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) acts as a key regulator of keratinocyte terminal differentiation.

In the skin, epithelial cells undergo a terminal differentiation program leading to the formation of the stratum corneum. Although it is expected that the last phases of this process must be tightly regulated since it results in cell death, the signaling pathways involved in this induction remain ill defined. We now report that a single kinase, the mitogen-activated protein kinase kinase kinase dual leucine zipper-bearing kinase (DLK), acts in the epidermis to promote the terminal differentiation of human keratinocytes. In support of this notion, we showed that DLK expression was restricted to the granular layer in situ. In addition, cultured keratinocytes infected with a recombinant adenovirus expressing DLK exhibited morphological and biochemical changes, including a suprabasal localization, altered cell shape, compacted cytoplasm, DNA fragmentation, and the up-regulation of filaggrin, that are reminiscent of a terminally differentiated phenotype. Moreover the expression of wild-type DLK in keratinocytes stimulated transglutaminase activity and the consequent formation of the cornified cell envelope, while a kinase-inactive variant of DLK did not. Together these results identify DLK as a signaling molecule implicated in the regulation of keratinocyte terminal differentiation and cornification

Down-regulation of the Mixed-lineage Dual Leucine Zipper-bearing Kinase by Heat Shock Protein 70 and Its Co-chaperone CHIP

Dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) is a mixed-lineage kinase family member that acts as an upstream activator of the c-Jun N-terminal kinases. As opposed to other components of this pathway, very little is currently known regarding the mechanisms by which DLK is regulated in mammalian cells. Here we identify the stress-inducible heat shock protein 70 (Hsp70) as a negative regulator of DLK expression and activity. Support for this notion derives from data showing that Hsp70 induces the proteasomal degradation of DLK when both proteins are co-expressed in COS-7 cells. Hsp70-mediated degradation occurs with expression of wild-type DLK, which functions as a constitutively activated protein in these cells but not kinase-defective DLK. Interestingly, the Hsp70 co-chaperone CHIP, an E3 ubiquitin ligase, seems to be indispensable for this process since Hsp70 failed to induce DLK degradation in COS-7 cells expressing a CHIP mutant unable to catalyze ubiquitination or in immortalized fibroblasts derived from CHIP knock-out mice. Consistent with these data, we have found that endogenous DLK becomes sensitive to CHIP-dependent proteasomal degradation when it is activated by okadaic acid and that down-regulation of Hsp70 levels with an Hsp70 antisense attenuates this sensitivity. Therefore, our studies suggest that Hsp70 contributes to the regulation of activated DLK by promoting its CHIP-dependent proteasomal degradation

Conséquences biochimiques et fonctionnelles de l'oligomérisation de la protéine kinase DLK par la transglutaminase de type II

L'apoptose est un processus de mort cellulaire génétiquement programmée se produisant lors de la différenciation et du développement normal des organismes multicellulaires. Les aberrations de la régulation de ce processus sont associées à l'apparition de divers désordres pathologiques. Un effecteur important de l'apoptose est la transglutaminase de type II (TG2), une enzyme Ca[exposant 2+]-dépendante catalysant la formation de liens covalents entre les résidus glutamines et lysines d'une même protéine ou de protéines différentes. Les mécanismes moléculaires par lesquels la TG2 favorise ou empêche l'apoptose sont mal définis, mais semblent impliquer des protéines intracellulaires spécifiques régulatrices de la mort des cellules. L'activation de la TG2 dans des cellules traitées avec le calphostin C, un inducteur d'apoptose, provoque la polymérisation (oligomérisation) de la protéine Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK), une composante importante de la cascade de signalisation de la kinase de stress c-jun N-terminal protein kinase (JNK). Cette cascade est reconnue pour son rôle dans de nombreux processus cellulaires. Ce travail a eu pour principal objectif de définir les conséquences de l'oligomérisation de DLK sur ses propriétés biochimiques et sur ses fonctions, particulièrement dans la régulation de l'apoptose. Dans une première publication, nous avons investigué les effets de l'oligomérisation de DLK, médiée par la TG2, sur l'apoptose. Nos résultats ont indiqué que, dans les cellules entrant en apoptose induite par le calphostin C, l'oligomérisation de DLK prenait place dans les phases précoces de la réponse apoptotique. La formation de l'oligomère augmente l'activité catalytique de DLK de façon significative, ainsi que son habileté à activer la voie de JNK. Fait important, nous avons aussi mis en évidence que l'oligomérisation de DLK facilitait l'entrée des cellules en apoptose, alors que l'oligomérisation d'un mutant inactif pour l'activité kinase de DLK ne produit pas cet effet. Dans une seconde publication, nous voulions déterminer le rôle de la TG2, de DLK et de JNK dans la réponse apoptotique induite par le calphostin C. Nos expérimentations ont révélé que l'apoptose induite par le calphostin C était clairement et majoritairement médiée par la voie de signalisation de JNK et menait à une mort cellulaire caspases-dépendante. La diminution d'expression de la TG2 ou de DLK par ARN interférent réduisait l'action du calphostin C sur l'activation de JNK et sur l'apoptose, alors que la diminution d'expression des deux protéines simultanément inhibait complètement ces phénomènes. Finalement, nous avons mis en évidence que la diminution d'expression de la TG2 bloquait complètement l'oligomérisation de DLK, confirmant le rôle crucial joué par TG2 dans la réponse apoptotique induite par le calphostin C. Ces résultats supposent que suite au traitement des cellules avec le calphostin C, l'activation de la TG2 mène à l'oligomérisation et à l'activation de la protéine kinase DLK. Cet oligomère constitutivement actif stimule de façon continue la kinase de stress JNK, facilitant ainsi l'entrée des cellules en apoptose d'une manière caspases-dépendante

Heteropolyacid/saponite-like clay complexes and their blends in amphiphilic SEBS

A synthetic saponite-like clay, Sumecton SA (SSA), was self-assembled with 12-phosphotungstic acid (PTA) heteropolyacid for the preparation of new hybrid nanocomposites for proton exchange membranes. Thermogravimetric analysis (TGA) and Fourier transformed diffuse reflectance spectroscopy (DRIFT) measurements indicate the formation of robust PTA\u2013SSA complexes. The Keggin structure of PTA is preserved within the complexes and is thermally stable up to 450 \ub0C. The amount of PTA incorporated into the clay depends on the PTA\u2013SSA weight ratio used for the complex preparation. PTA incorporation achieved is approximately 2\u20133 times the PTA content of most reported literature. However, higher PTA incorporation is accompanied by a significant loss of structural clay integrity. Low PTA\u2013SSA weight ratios tend to preserve clay structure, but do not preclude its general amorphization generated by the PTA acidic treatment. PTA\u2013SSA complexes present a low degree of order. Inorganic complexes were blended by melt extrusion with chemically modified styrene/ethylene-co-butylene/styrene block copolymer (SEBS). Poly(oxyethylene/oxypropylene)-grafted-SEBS is more efficient than maleic anhydride-grafted-SEBS at dispersing PTA\u2013SSA complexes. For both nanocomposite systems, nanoparticles\u2019 size varies between 30 and 300 nm.Peer reviewed: YesNRC publication: Ye

Bovine colostrum increases the viability and the healing process of IPEC-J2 intestinal porcine epithelial cells while modulating the barrier function and <i>Escherichia coli-</i>mediated inflammatory responses.

Abstract Piglet gut response to weaning results in impaired intestinal barrier function, increased inflammatory response and susceptibility to enteric diseases. As the use of antibiotics as growth promoters will be restricted in the swine industry in Canada, novel feeding strategies to improve gut health are needed. This study aims to determine the potential of defatted bovine colostrum (BC) and its fractions, the serocolostrum (SC) and caseins (CAS), to promote viability and the healing process and to modulate barrier integrity and the inflammatory response induced by enterotoxigenic E. coli (ETEC) in IPEC-J2 intestinal epithelial porcine cells. To evaluate cell viability and wound healing, XTT cell proliferation and migration scratch assays were performed on IPEC-J2 cells incubated with BC, SC, or CAS. Monolayer permeability of ETEC infected IPEC-J2 cells incubated with BC, SC or CAS was monitored by transepithelial electrical resistance measurements. Inflammatory and oxidative responses were assessed by gene expression analysis of several cytokines and chemokines by qPCR. Incubation with BC derivatives led to 8 to 14% increases IPEC-J2 cell viability, in comparison to untreated cells (P ≤ 0.05). IPEC-J2 cell migration was increased by 42% after SC addition, as opposed to non-treated cells (P ≤ 0.05). BC and SC treatments significantly reduced ETEC-mediated increases in IL-8 and CCL20 expression (P ≤ 0.05). BC treatment also significantly reduced IPEC-J2 cell monolayer permeability induction after ETEC infection. These results show that BC and SC fractions improve intestinal epithelial cell integrity and decrease ETEC-mediated inflammatory responses. Therefore, BC should be considered as a potential alternative to antibiotics.</jats:p

Computational identification of RNA functional determinants by three-dimensional quantitative structure–activity relationships

Anti-infection drugs target vital functions of infectious agents, including their ribosome and other essential non-coding RNAs. One of the reasons infectious agents become resistant to drugs is due to mutations that eliminate drug-binding affinity while maintaining vital elements. Identifying these elements is based on the determination of viable and lethal mutants and associated structures. However, determining the structure of enough mutants at high resolution is not always possible. Here, we introduce a new computational method, MC-3DQSAR, to determine the vital elements of target RNA structure from mutagenesis and available high-resolution data. We applied the method to further characterize the structural determinants of the bacterial 23S ribosomal RNA sarcin–ricin loop (SRL), as well as those of the lead-activated and hammerhead ribozymes. The method was accurate in confirming experimentally determined essential structural elements and predicting the viability of new SRL variants, which were either observed in bacteria or validated in bacterial growth assays. Our results indicate that MC-3DQSAR could be used systematically to evaluate the drug-target potentials of any RNA sites using current high-resolution structural data