Effets de l'adiponectine sur les cellules endométriales porcines

Il est maintenant reconnu qu'un excès ou un manque de tissu adipeux peut avoir un impact négatif sur la reproduction porcine. Ainsi, une faible adiposité résulte en une augmentation du temps requis pour le premier oestrus, une diminution des tailles de portées et une augmentation de l'intervalle sevrage-oestrus. Les producteurs de porcs étant payés selon le rendement en maigre des carcasses de porcs envoyés aux abattoirs, la sélection génétique des dernières années a surtout été orientée vers la production de porcs de plus en plus maigres. Cependant, cette réduction du tissu adipeux a, du même coup, entraîné de nombreux problèmes de reproduction et un taux de réforme des truies de plus en plus élevé. Nous savons aujourd'hui que les cellules adipeuses sont le siège d'une activité métabolique intense et qu'elles sont capables de sécréter une multitude de facteurs vers la circulation sanguine. Parmi ces facteurs, nous retrouvons diverses adipokines telles la leptine et l'adiponectine, lesquelles auraient des effets bénéfiques sur les organes reproducteurs. L'adiponectine est l'adipokine la plus abondamment sécrétée par le tissu adipeux et la présence de ses récepteurs, AdipoR1 et AdipoR2, au niveau des ovaires et de l'utérus de la truie suggère un rôle pour l'adiponectine sur diverses fonctions reproductrices. Dans cette étude, nous avons voulu déterminer l'effet de l'adiponectine recombinante sur l'utérus de la truie en utilisant un modèle in vitro de culture de cellules endométriales primaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la modulation de l'expression de cette adipokine et de ses récepteurs pendant le cycle oestral et au début de la gestation. Utilisant la méthode de PCR en temps réel, nous avons tout d'abord confirmé la présence des récepteurs AdipoRl, AdipoR2 et cadhérine 13 dans l'endomètre de la truie et constaté que l'expression de ces gènes est modulée pendant le cycle oestral, étant à son maximum au milieu de la phase lutéale. Nous avons aussi observé une modulation de l'expression de l'adiponectine dans le tissu adipeux sous-cutané, avec un transcrit plus abondant chez les truies hypo-prolifiques (? 10 porcelets par portée) et les truies cycliques, comparativement aux truies hyper-prolifiques (? 15 porcelets par portée) et gestantes (jour 15 de la gestation), respectivement. Dans l'endomètre, le récepteur AdipoR2 est plus fortement exprimé chez la truie gestante que chez la cyclique, alors qu'il est plus élevé chez les truies hypo-prolifiques que chez les hyper-prolifiques. Chez l'embryon de 15 jours, le profil inverse est observé, avec une quantité plus élevée de transcrits observée pour les récepteurs AdipoRl et AdipoR2 chez les embryons issus des truies hyper-prolifiques. Bien que l'expression de la cadhérine 13 soit modulée pendant le cycle oestral, la gestation (cyclique vs gestante) et la prolificité (hyper- vs hypo-prolifique) ne présentent aucun effet significatif sur son expression. Finalement, l'utilisation de culture de cellules stromales endométriales primaires traitées à l'adiponectine recombinante a révélé une augmentation de l'expression en ARN messager des gènes de la prostaglandine synthétase 2 (PTGS2) et du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), deux gènes ayant un rôle clé en début de gestation pour la survie embryonnaire. De plus, cette modulation de l'expression génique serait médiée par l'activation des voies de signalisation de la MAPK-ERK1/2 et de la kinase activée par l'AMP (AMPK). Collectivement, ces résultats suggèrent une implication directe de l'adiponectine sur les cellules endométriales porcines et dans les processus de reproduction chez la truie, autant pendant le cycle oestral qu'en début de gestation. De plus, nos résultats identifient l'adiponectine comme un régulateur potentiel des adaptations métaboliques se produisant en début de gestation

Hypoxia-Induced Invadopodia Formation Involves Activation of NHE-1 by the p90 Ribosomal S6 Kinase (p90RSK)

The hypoxic and acidic microenvironments in tumors are strongly associated with malignant progression and metastasis, and have thus become a central issue in tumor physiology and cancer treatment. Despite this, the molecular links between acidic pH- and hypoxia-mediated cell invasion/metastasis remain mostly unresolved. One of the mechanisms that tumor cells use for tissue invasion is the generation of invadopodia, which are actin-rich invasive plasma membrane protrusions that degrade the extracellular matrix. Here, we show that hypoxia stimulates the formation of invadopodia as well as the invasive ability of cancer cells. Inhibition or shRNA-based depletion of the Na+/H+ exchanger NHE-1, along with intracellular pH monitoring by live-cell imaging, revealed that invadopodia formation is associated with alterations in cellular pH homeostasis, an event that involves activation of the Na+/H+ exchange rate by NHE-1. Further characterization indicates that hypoxia triggered the activation of the p90 ribosomal S6 kinase (p90 RSK), which resulted in invadopodia formation and site-specific phosphorylation and activation of NHE-1. This study reveals an unsuspected role of p90RSK in tumor cell invasion and establishes p90RS kinase as a link between hypoxia and the acidic microenvironment of tumors

SMAD2, SMAD3 and SARA : key TGFβ signaling elements involved in cancer cell invasion stimulated by the hypoxic tumor microenvironment

La dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme et la formation de métastases est la principale cause de décès des patients atteints de cancer et un des grands défis pour le clinicien et le chercheur. Même si on sait que la dissémination métastatique est stimulée par le microenvironnement particulier des tumeurs, aucune thérapie ne cible ce processus de façon spécifique, faute de connaissances approfondies des mécanismes en cause. Il a été démontré que des éléments du microenvironnement tumoral, notamment l’hypoxie et le TGF induisent la formation d’invadopodes, des structures cellulaires permettant la dégradation localisée de la matrice extracellulaire et nécessaires à la formation de métastases. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’élucidation des mécanismes moléculaires induits par l’hypoxie qui favorisent l’acquisition des propriétés invasives des cellules cancéreuses. Dans le premier chapitre, nous avons étudié l’implication du facteur de transcription le plus fortement régulé en hypoxie, soit HIF, dans l’invasion des cellules cancéreuses. Nous démontrons que la modulation de la stabilité ou de l’expression de HIF-1 et HIF-2 n’affecte pas la production d’invadopodes ni la capacité des cellules à migrer à l’intérieur d’une matrice de collagène tridimensionnelle, suggérant que HIF est dispensable à l’induction de l’invasion des cellules cancéreuses en réponse à l’hypoxie. Dans le second chapitre, nous démontrons que les acteurs principaux de la signalisation du TGF SMAD2 et SMAD3, jouent des rôles opposés dans l’invasion des cellules cancéreuses : SMAD2 agissant comme inhibiteur, et SMAD3 promouvant la production d’invadopodes. Ces rôles opposés peuvent être attribués à la modulation de gènes cibles distincts par SMAD2 et SMAD3. Nous proposons un mécanisme d’activation sélective de SMAD3 impliquant la phosphorylation de la région de liaison de SMAD3. Le troisième chapitre présente une étude des fonctions de SARA dans la progression tumorale. La combinaison de résultats issus d’une étude de l’interactome de SARA, d’essais d’invasions in vitro et d’essais de xénogreffes et de métastases spontanées in vivo supportent un rôle de suppresseur de tumeur de SARA. Cependant, l’hypoxie semble plutôt favoriser un rôle pro-tumoral de SARA en augmentant le recrutement de plusieurs partenaires d’interaction impliqués dans la prolifération et l’invasion cellulaire. L’ensemble de nos travaux démontrent l’importance du développement d’approches thérapeutiques ciblant la fonction pro-invasive du TGF découlant de l’interaction entre SMAD3 et SARA, directement ou par le biais d’un partenaire d’interaction commun, plutôt que celles visant l’inhibition globale de la signalisation du TGFβ.Abstract : Metastasis is the leading cause of cancer patient death and constitutes one of the biggest challenges for both clinicians and researchers. Although it is well known that metastasis is stimulated by the tumor microenvironment, no therapy targeting metastasis specifically has yet been approved mostly due to the lack of knowledge of the mechanisms involved in this process. It has been demonstrated that hypoxia and TGFb, two central elements of the tumor microenvironment, can induce the production of invadopodia, which are cell protrusions specialized in focal matrix degradation leading to the metastatic spread of cancer cells. The work presented in this thesis focuses on uncovering the hypoxia-induced molecular mechanisms that stimulate cancer cell invasive properties. In the first chapter, we studied the role of the most strongly regulated transcription factor in hypoxia, HIF, in cancer cell invasion. We demonstrate that modulating the stability or the expression of HIF-1a and HIF-2a does not affect invadopodia production by cancer cells or their ability to invade through a 3D collagen matrix, suggesting that HIFs are dispensable for hypoxiainduced cancer cell invasion. In the second chapter, we demonstrate that the central effectors of TGFb signaling, SMAD2 and SMAD3, play distinct opposing roles in cancer cell invasion: SMAD2 acting as an inhibitor while SMAD3 promotes invadopodia production. These opposing roles could be attributed to the modulation of distinct target gene sets by SMAD2 and SMAD3. We propose a selective SMAD3 activation pathway involving linker phosphorylation of SMAD3 under hypoxic conditions. The third chapter presents a study of the role of the SARA adaptor protein in tumor progression. The combination of SARA interactomics analysis, in vitro invasion assays and in vivo xenograft and spontaneous metastasis assays support a tumor suppressor function for SARA. In contrast, hypoxia appears to promote a pro-tumorigenic role for SARA, increasing its interaction with several proteins involved in proliferation and invasion. Together, our results suggest that the development of therapeutic approaches targeting SMAD3- SARA directly or through a common binding partner, would be more efficient in blocking the proinvasive branch of the TGFb signaling pathway than those inhibiting TGFb signaling globally

Effets de l'adiponectine sur les cellules endométriales porcines

Il est maintenant reconnu qu'un excès ou un manque de tissu adipeux peut avoir un impact négatif sur la reproduction porcine. Ainsi, une faible adiposité résulte en une augmentation du temps requis pour le premier oestrus, une diminution des tailles de portées et une augmentation de l'intervalle sevrage-oestrus. Les producteurs de porcs étant payés selon le rendement en maigre des carcasses de porcs envoyés aux abattoirs, la sélection génétique des dernières années a surtout été orientée vers la production de porcs de plus en plus maigres. Cependant, cette réduction du tissu adipeux a, du même coup, entraîné de nombreux problèmes de reproduction et un taux de réforme des truies de plus en plus élevé. Nous savons aujourd'hui que les cellules adipeuses sont le siège d'une activité métabolique intense et qu'elles sont capables de sécréter une multitude de facteurs vers la circulation sanguine. Parmi ces facteurs, nous retrouvons diverses adipokines telles la leptine et l'adiponectine, lesquelles auraient des effets bénéfiques sur les organes reproducteurs. L'adiponectine est l'adipokine la plus abondamment sécrétée par le tissu adipeux et la présence de ses récepteurs, AdipoR1 et AdipoR2, au niveau des ovaires et de l'utérus de la truie suggère un rôle pour l'adiponectine sur diverses fonctions reproductrices. Dans cette étude, nous avons voulu déterminer l'effet de l'adiponectine recombinante sur l'utérus de la truie en utilisant un modèle in vitro de culture de cellules endométriales primaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la modulation de l'expression de cette adipokine et de ses récepteurs pendant le cycle oestral et au début de la gestation. Utilisant la méthode de PCR en temps réel, nous avons tout d'abord confirmé la présence des récepteurs AdipoRl, AdipoR2 et cadhérine 13 dans l'endomètre de la truie et constaté que l'expression de ces gènes est modulée pendant le cycle oestral, étant à son maximum au milieu de la phase lutéale. Nous avons aussi observé une modulation de l'expression de l'adiponectine dans le tissu adipeux sous-cutané, avec un transcrit plus abondant chez les truies hypo-prolifiques (? 10 porcelets par portée) et les truies cycliques, comparativement aux truies hyper-prolifiques (? 15 porcelets par portée) et gestantes (jour 15 de la gestation), respectivement. Dans l'endomètre, le récepteur AdipoR2 est plus fortement exprimé chez la truie gestante que chez la cyclique, alors qu'il est plus élevé chez les truies hypo-prolifiques que chez les hyper-prolifiques. Chez l'embryon de 15 jours, le profil inverse est observé, avec une quantité plus élevée de transcrits observée pour les récepteurs AdipoRl et AdipoR2 chez les embryons issus des truies hyper-prolifiques. Bien que l'expression de la cadhérine 13 soit modulée pendant le cycle oestral, la gestation (cyclique vs gestante) et la prolificité (hyper- vs hypo-prolifique) ne présentent aucun effet significatif sur son expression. Finalement, l'utilisation de culture de cellules stromales endométriales primaires traitées à l'adiponectine recombinante a révélé une augmentation de l'expression en ARN messager des gènes de la prostaglandine synthétase 2 (PTGS2) et du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), deux gènes ayant un rôle clé en début de gestation pour la survie embryonnaire. De plus, cette modulation de l'expression génique serait médiée par l'activation des voies de signalisation de la MAPK-ERK1/2 et de la kinase activée par l'AMP (AMPK). Collectivement, ces résultats suggèrent une implication directe de l'adiponectine sur les cellules endométriales porcines et dans les processus de reproduction chez la truie, autant pendant le cycle oestral qu'en début de gestation. De plus, nos résultats identifient l'adiponectine comme un régulateur potentiel des adaptations métaboliques se produisant en début de gestation

Hypoxia Downregulates LPP3 and Promotes the Spatial Segregation of ATX and LPP1 During Cancer Cell Invasion

Hypoxia is a common characteristic of advanced solid tumors and a potent driver of tumor invasion and metastasis. Recent evidence suggests the involvement of autotaxin (ATX) and lysophosphatidic acid receptors (LPARs) in cancer cell invasion promoted by the hypoxic tumor microenvironment; however, the transcriptional and/or spatiotemporal control of this process remain unexplored. Herein, we investigated whether hypoxia promotes cell invasion by affecting the main enzymes involved in its production (ATX) and degradation (lipid phosphate phosphatases, LPP1 and LPP3). We report that hypoxia not only modulates the expression levels of lysophosphatidic acid (LPA) regulatory enzymes but also induces their significant spatial segregation in a variety of cancers. While LPP3 expression was downregulated by hypoxia, ATX and LPP1 were asymmetrically redistributed to the leading edge and to the trailing edge, respectively. This was associated with the opposing roles of ATX and LPPs in cell invasion. The regulated expression and compartmentalization of these enzymes of opposing function can provide an effective way to control the generation of an LPA gradient that drives cellular invasion and migration in the hypoxic zones of tumors

Hypoxia Selectively Increases a SMAD3 Signaling Axis to Promote Cancer Cell Invasion

Transforming growth factor β (TGFβ) plays a paradoxical role in cancer, first inhibiting then promoting its progression, a duality that poses a real challenge for the development of effective TGFβ-targeted therapies. The major TGFβ downstream effectors, SMAD2 and SMAD3, display both distinct and overlapping functions and accumulating evidence suggests that their activation ratio may contribute to the dual effect of TGFβ. However, the mechanisms responsible for their selective activation remain poorly understood. Here, we provide experimental evidence that hypoxia induces the pro-invasive arm of TGFβ signaling through a selective increase in SMAD3 interaction with SMAD-Anchor for Receptor Activation (SARA). This event relies on HDAC6-dependent SMAD3 bioavailability, as well as increased SARA recruitment to EEA1+ endosomes. A motility gene expression study indicated that SMAD3 selectively increased the expression of ITGB2 and VIM, two genes that were found to be implicated in hypoxia-induced cell invasion and associated with tumor progression and metastasis in cohorts of cancer patients. Furthermore, CAM xenograft assays show the significant benefit of selective inhibition of the SMAD3 signaling pathway as opposed to global TGFβ inhibition in preventing tumor progression. Overall, these results suggest that fine-tuning of the pro-invasive HDAC6-SARA-SMAD3 axis could be a better strategy towards effective cancer treatments

HDAC6 Deacetylase Activity Is Required for Hypoxia-Induced Invadopodia Formation and Cell Invasion

<div><p>Despite significant progress in the cancer field, tumor cell invasion and metastasis remain a major clinical challenge. Cell invasion across tissue boundaries depends largely on extracellular matrix degradation, which can be initiated by formation of actin-rich cell structures specialized in matrix degradation called invadopodia. Although the hypoxic microenvironment within solid tumors has been increasingly recognized as an important driver of local invasion and metastasis, little is known about how hypoxia influences invadopodia biogenesis. Here, we show that histone deacetylase 6 (HDAC6), a cytoplasmic member of the histone deacetylase family, is a novel modulator of hypoxia-induced invadopodia formation. Hypoxia was found to enhance HDAC6 tubulin deacetylase activity through activation of the EGFR pathway. Activated HDAC6, in turn, triggered Smad3 phosphorylation resulting in nuclear accumulation. Inhibition of HDAC6 activity or knockdown of the protein inhibited both hypoxia-induced Smad3 activation and invadopodia formation. Our data provide evidence that hypoxia influences invadopodia formation in a biphasic manner, which involves the activation of HDAC6 deacetylase activity by EGFR, resulting in enhanced Smad phosphorylation and nuclear accumulation. The identification of HDAC6 as a key participant of hypoxia-induced cell invasion may have important therapeutic implications for the treatment of metastasis in cancer patients.</p> </div

The Smad3-dependent signaling pathway is involved in hypoxia-induced invadopodia formation.

<p>(<b>A, B</b>) HT-1080 cells were seeded on gelatin-coated slides and incubated in the presence or absence of TGFβ or in hypoxia for 3, 6 or 16 h. Cells were labeled for p-Smad3 and nucleus (DAPI) and analyzed by confocal microscopy. (<b>A</b>) Micrographs of p-Smad3 (red), nucleus (blue) and merged images (binary mask-overlay). (<b>B</b>) Graph showing the percentage of colocalization of p-Smad3 with nucleus measured as described under Materials and Methods. (<b>C</b>) Cells were seeded on FITC-gelatin-coated slides, preincubated in the presence or absence of SIS3 or Ly364947 for 30 min and incubated in normoxia in the presence or absence of TGFβ or hypoxia for 10 h. The graph shows the percentage of cells forming invadopodia. Columns correspond to the mean ± SEM; ** p = 0.01, *** p < 0.001; Scale bars correspond to 5 µm.</p

Proposed mechanisms involved in invadopodia formation under hypoxia.

<p>The hypoxic microenvironment in solid tumor is proposed to influence invadopodia formation through a biphasic mechanism involving the regulation of HDAC6, followed by activation of the TGFβ/Smad3-dependent signaling pathway. First, hypoxia leads to the activation of the EGF/EGFR pathway, which enhances HDAC6 tubulin deacetylase activity. In parallel, hypoxia increases the expression of the proprotein convertase furin, resulting in enhanced TGFβ processing and bioactivation. HDAC6 tubulin deacetylation may allow the desequestration of Smad3 from the MT network leading to its activation and nuclear translocation. Smad3 translocation leads to enhanced transcription of TGFβ inducible genes and invadopodia production. In this model, HDAC6 might also translocate to the cell periphery where it was shown to be involved in cortactin deacetylation <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0055529#pone.0055529-Kaluza1" target="_blank">[31]</a> an event needed for the formation of actin-rich invadopodia structures.</p

Hypoxia promotes invadopodia formation.

<p>HT-1080 cells were cultured on FITC-gelatin-coated slides in normoxia or hypoxia for 4 h (<b>B</b>) or 10 h (<b>A, C</b>). (<b>A</b>) Percentage of cells forming invadopodia. (<b>B</b>) Micrographs of actin (green), cortactin (red) nucleus (blue) and merged images are shown. The associated graph shows the number of F-actin-positive and cortactin-positive invadopodia per cell as described under Materials and Methods. (<b>C</b>) Quantification of ECM degradation (area/cell). The associated micrographs show representative ECM degradation area for a single cell. Columns correspond to the mean ± SEM; ** p < 0.01, *** p < 0.001; scale bars correspond to 5 µm.</p