Quantitative Detection and Biological Propagation of Scrapie Seeding Activity In Vitro Facilitate Use of Prions as Model Pathogens for Disinfection

Prions are pathogens with an unusually high tolerance to inactivation and constitute a complex challenge to the re-processing of surgical instruments. On the other hand, however, they provide an informative paradigm which has been exploited successfully for the development of novel broad-range disinfectants simultaneously active also against bacteria, viruses and fungi. Here we report on the development of a methodological platform that further facilitates the use of scrapie prions as model pathogens for disinfection. We used specifically adapted serial protein misfolding cyclic amplification (PMCA) for the quantitative detection, on steel wires providing model carriers for decontamination, of 263K scrapie seeding activity converting normal protease-sensitive into abnormal protease-resistant prion protein. Reference steel wires carrying defined amounts of scrapie infectivity were used for assay calibration, while scrapie-contaminated test steel wires were subjected to fifteen different procedures for disinfection that yielded scrapie titre reductions of ≤101- to ≥105.5-fold. As confirmed by titration in hamsters the residual scrapie infectivity on test wires could be reliably deduced for all examined disinfection procedures, from our quantitative seeding activity assay. Furthermore, we found that scrapie seeding activity present in 263K hamster brain homogenate or multiplied by PMCA of scrapie-contaminated steel wires both triggered accumulation of protease-resistant prion protein and was further propagated in a novel cell assay for 263K scrapie prions, i.e., cerebral glial cell cultures from hamsters. The findings from our PMCA- and glial cell culture assays revealed scrapie seeding activity as a biochemically and biologically replicative principle in vitro, with the former being quantitatively linked to prion infectivity detected on steel wires in vivo. When combined, our in vitro assays provide an alternative to titrations of biological scrapie infectivity in animals that substantially facilitates the use of prions as potentially highly indicative test agents in the search for novel broad-range disinfectants

Accumulation of Pathological Prion Protein PrPSc in the Skin of Animals with Experimental and Natural Scrapie

Prion infectivity and its molecular marker, the pathological prion protein PrPSc, accumulate in the central nervous system and often also in lymphoid tissue of animals or humans affected by transmissible spongiform encephalopathies. Recently, PrPSc was found in tissues previously considered not to be invaded by prions (e.g., skeletal muscles). Here, we address the question of whether prions target the skin and show widespread PrPSc deposition in this organ in hamsters perorally or parenterally challenged with scrapie. In hamsters fed with scrapie, PrPSc was detected before the onset of symptoms, but the bulk of skin-associated PrPSc accumulated in the clinical phase. PrPSc was localized in nerve fibres within the skin but not in keratinocytes, and the deposition of PrPSc in skin showed no dependence from the route of infection and lymphotropic dissemination. The data indicated a neurally mediated centrifugal spread of prions to the skin. Furthermore, in a follow-up study, we examined sheep naturally infected with scrapie and detected PrPSc by Western blotting in skin samples from two out of five animals. Our findings point to the skin as a potential reservoir of prions, which should be further investigated in relation to disease transmission

Inaktivierung und Entfernung von Prionen bei der Aufbereitung von Medizinprodukten

Zu den Aufgaben des Robert Koch-Institutes (RKI) gehört es, gesundheitliche Risiken zu identifizieren, zu analysieren und Maßnahmen bzw. Empfehlungen zu ihrer Minimierung zu erarbeiten und zu kommunizieren. Dementsprechend wurde in Reaktion auf die BSE-Problematik in einer umfangreichen Arbeitsgruppe beim RKI der Bericht der ldquorTask Force vCJKldquo zur Minimierung des Risikos einer iatrogenen Übertragung von Prionen durch chirurgische Instrumente erarbeitet und im April 2002 auf der Basis der damaligen Kenntnis veröffentlicht [1]. Danach stellt eine geeignete alkalische Reinigung mit anschließender Dampfsterilisation bei 134°C ein routinefähiges Verfahren zur Minimierung des Übertragungsrisikos von Prionen durch chirurgische Instrumente dar. Vorliegende Ergebnisse zur inaktivierenden Wirkung anderer Verfahren wurden bisher mit unterschiedlichen Prüfmethoden gewonnen und nach individuellen Kriterien bewertet. Wir teilen deshalb die Meinung von Experten, dass eine Vereinheitlichung der Prüfmethoden erforderlich ist [2], nicht zuletzt um die Entwicklung weiterer für die Routine und spezielle Anforderungen geeigneter Verfahren zur Dekontamination von Prionen zu fördern. Wir möchten hier Anforderungen an die Prüfung und Deklaration entsprechender Verfahren zur Diskussion stellen. Ausdrücklich wird darauf hingewiesen, dass in allen Fällen eines erkennbaren Risikos für das Vorliegen einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE) den bestehenden Empfehlungen des RKI [1, 3] zu folgen ist

Fast broad-range disinfection of bacteria, fungi, viruses and prions

Effective disinfectants are of key importance for the safe handling and reprocessing of surgical instruments. We tested whether new formulations containing SDS, NaOH and 1-propanol (n-propanol) are simultaneously active against a broad range of pathogens including bacteria, fungi, non-enveloped viruses and prions. Inactivation and disinfection were examined in suspension and on carriers, respectively, using coagulated blood or brain homogenate as organic soil. Coomassie blue staining was used to assess whether formulations did undesirably fix proteins to rough surfaces. A mixture of 0.2% SDS and 0.3% NaOH in 20% n-propanol achieved potent decontamination of steel carriers contaminated with PrPTSE, the biochemical marker for prion infectivity, from 263K scrapie hamsters, or patients with sporadic or variant Creutzfeldt-Jakob disease. 263K scrapie infectivity on carriers was decreased by ≥5.5 log10 units [logs]. Furthermore, the formulation effectively inactivated poliovirus, hepatitis A virus and caliciviruses (including murine norovirus) in suspension tests. It also yielded significant titre reductions of bacteria (E. faecium, M. avium; >6 logs), fungi (spores of Aspergillus niger; >5 logs) or poliovirus (≥4 logs) embedded in coagulated blood on carriers. The formulation was not found to fix proteins more than was observed with water as cleaning reagent. SDS, NaOH and n-propanol can synergistically achieve fast broad-range disinfection

Desinfektion von Persönlicher Schutzausrüstung

Die Dekontamination von Persönlicher Schutzausrüstung (PSA) in biologischer Gefahrenlage mit Verdacht auf Kontamination der PSA durch ein hochpathogenes biologisches Agens sollte effektiv, in kurzer Zeit durchführbar und anwenderkompatibel sein. Die Erfahrungen im Bezug auf die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln auf PSA-Materialien sind limitiert und evidenzbasierte Empfehlungen über ihre Anwendung bei Verdacht auf Kontamination mit hochpathogenen Agenzien, insbesondere den resistenten Bacillus-Sporen nicht verfügbar. Unser Auftrag bestand in der Etablierung eines standardisierten Prüfverfahrens zur Bewertung von Desinfektionsmitteln hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf PSA-Oberflächen gegen unterschiedliche Klassen von biologischen Agenzien und Prüfung der im Laborversuch gewonnenen Erfahrungen in Praxisversuchen. Im Hinblick auf die o. g. Kriterien, die hochwirksamen antimikrobiellen und zusätzlich sporiziden Eigenschaften, stand als Desinfektionsmittel Peressigsäure im Fokus unserer Studie. Zur Entwicklung von Prüfmodellen nach dem Prinzip der quantitativen Keimträgertestung wurden zunächst Sporen von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Surrogat für B. anthracis eingesetzt. Die Sporen wurden auf Keimträger aus PSA-Materialien aufgetragen und durch Lufttrocknen auf der Oberfläche fixiert. Drei verschiedene Prüfmodelle wurden entwickelt, die sich in der Desinfektionsmittelmenge und der Auftragungstechnik voneinander unterschieden: Im Modell 1 wurde der Keimträger (1,0 x 0,8 cm) vollständig mit 1 ml PES überschichtet (Tauchmodell), im Modell 2 wurde lediglich die kontaminierte Oberfläche des Keimträgers (Größe: 2,5 x 2,2 cm) mit 100 μl oder 50 μl PES tropfenförmig ohne mechanische Einwirkung überschichtet (Überschichtung ohne Mechanik) und im Modell 3 erfolgte die Überschichtung der kontaminierten und umgebenden Fläche (2 cm2) mit 10 μl PES unter mechanischer Verteilung als dünner Flüssigkeitsfilm (Überschichtung mit Mechanik). Durch Zugabe von z. B. 0,2 % SDS als Detergenz konnte die Oberflächenspannung der PES-Lösung deutlich reduziert und damit eine bessere Flächenbenetzung der hydrophoben PSA-Oberfläche erreicht werden. Die Wirksamkeit der PES gegen Sporen von B. subtilis ATCC 6633 konnte mit jedem der Modelle bestätigt werden. Unter den Versuchsbedingungen reduzierten 1,0 % und 0,5 % PES innerhalb von 2-3 min die keimungsfähigen Sporen bis zu der methodisch bedingten Nachweisgrenze von ca. 6 log10-Stufen. Modell 3 (Überschichtung mit Mechanik) wurde aufgrund der strengen und der Praxis am nächsten kommenden Prüfbedingungen (geringes Desinfektionsmittelvolumen und Auftragung durch mechanische Verteilung) als Standardprüfverfahren favorisiert und unter unterschiedlichen Bedingungen (niedrige Temperaturen, organische Belastung, unterschiedliche PSA-Materialien) erfolgreich getestet. Die Untersuchungen von B. anthracis-Sporen zeigten, dass sich diese durch eine höhere PES-Toleranz auszeichneten als die verwendeten Surrogatsporen. Mit B. anthracis-Sporen wurde die maximal ermittelbare Sporenreduktion (≥ 5 log10) innerhalb einer Einwirkzeit von 2-3 min mit 2,0 % PES erreicht. Auf der Suche nach einem ähnlich resistenten, jedoch apathogenen Sporensurrogat wurde schließlich der B. thuringiensis-Stamm DSM 350 ausgewählt. Die Behandlung der Sporen dieses Stammes mit 2,0 % PES ± Tenside (0,2 % SDS oder ein SLES-haltiges Produkt) führte unter Anwendung der Prüfmodelle 2 und 3 (Überschichtung ohne und mit Mechanik) innerhalb von 3-5 min zu einer Reduktion von keimungsfähigen Sporen von > 5-6 log10-Stufen. Ähnlich wie mit den Sporen des B. subtilis-Stammes wurden auch mit den B. thuringiensis-Sporen gut reproduzierbare Ergebnisse erhalten. Diese Sporen erwiesen sich als ein geeignetes Surrogat zur Optimierung des Prüfmodells 3 (Überschichtung mit Mechanik) als Standardprüfverfahren zur Testung der sporiziden Wirkung von Desinfektionsmitteln auf PSA. Auch mit Vaccinia- und Adenovirus sowie Rizin als Kontaminanten konnte die Wirksamkeit von PES in dem Standardprüfverfahren untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass 0,1 % PES schon nach 1 min eine Reduktion der Viren bis zur maximal ermittelbaren Reduktion von 5 bzw. 6 log10-Stufen bewirkte. Um eine deutliche Reduktion der Rizinaktivität zu erreichen, waren allerdings eine PESKonzentration von 2,0 % und eine Einwirkzeit von 10 min erforderlich. Die anhand der Prüfmodelle 2 und 3 ermittelten sporizid wirksamen Parameter wurden auf ihre Effektivität in der Praxis mit einer Schaufensterpuppe oder Probanden in PSA getestet. Die Kontamination der PSA erfolgte mit B. thuringiensis- Sporen. Durch Begießen oder Besprühen unter leichtem Druck mit 2,0 % PES in Kombination mit 0,2 % Tensid wurde innerhalb von 5 min eine hohe Sporenreduktion auf der PSA-Oberfläche erreicht. Dieser Effekt konnte noch durch zusätzliche mechanische Verteilung der PES/Tensid-Lösung auf der PSA-Oberfläche erhöht werden. Aufgrund der guten Korrelation zwischen den Modellergebnissen und den Ergebnissen der Praxisversuche schlagen wir vor, das Standardprüfverfahren (Überschichtung mit Mechanik) alleine oder in Kombination mit Prüfmodell 2 (Überschichtung ohne Mechanik) zur Vorprüfung von Desinfektionsmitteln bezüglich ihrer sporiziden Wirkung auf PSA-Oberflächen zu verwenden. Die Praxistauglichkeit sollte anschließend im Rahmen einer Validierung unter Praxisbedingungen verifiziert werden. Voraussetzung ist, dass die verwendeten Testorganismen bzw. -sporen hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber dem zu prüfenden Desinfektionsmittel den tatsächlichen Zielagenzien entsprechen. Die Prüfverfahren bieten eine Reihe von Variationsmöglichkeiten, z. B. können unterschiedliche PSA-Materialien und unterschiedliche Agenzien als Kontaminanten getestet werden. Darüber hinaus ermöglichen die Modelle, Untersuchungen zur Optimierung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln durchzuführen