Soyuretox, an intrinsically disordered polypeptide derived from soybean (Glycine max) ubiquitous urease with potential use as a biopesticide

Ureases from different biological sources display non-ureolytic properties that contribute to plant defense, in addition to their classical enzymatic urea hydrolysis. Antifungal and entomotoxic effects were demonstrated for Jaburetox, an intrinsically disordered polypeptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Here we describe the properties of Soyuretox, a polypeptide derived from soybean (Glycine max) ubiquitous urease. Soyuretox was fungitoxic to Candida albicans, leading to the production of reactive oxygen species. Soyuretox further induced aggregation of Rhodnius prolixus hemocytes, indicating an interference on the insect immune response. No relevant toxicity of Soyuretox to zebrafish larvae was observed. These data suggest the presence of antifungal and entomotoxic portions of the amino acid sequences encompassing both Soyuretox and Jaburetox, despite their small sequence identity. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and circular dichroism (CD) spectroscopic data revealed that Soyuretox, in analogy with Jaburetox, possesses an intrinsic and largely disordered nature. Some folding is observed upon interaction of Soyuretox with sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles, taken here as models for membranes. This observation suggests the possibility for this protein to modify its secondary structure upon interaction with the cells of the affected organisms, leading to alterations of membrane integrity. Altogether, Soyuretox can be considered a promising biopesticide for use in plant protection.Fil: Kappaun, Karine. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Martinelli, Anne H. S.. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Broll, Valquiria. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Zambelli, Barbara. Universidad de Bologna; ItaliaFil: Lopes, Fernanda C.. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Ligabue-Braun, Rodrigo. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Fruttero, Leonardo Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Moyetta, Natalia Rita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Bonan, Carla D.. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Carlini, Célia Regina R. S.. Pontificia Universidade Católica do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Ciurli, Stefano. Universidad de Bologna; Itali

Clonagem e expressão da urease da bactéria diazotrófica Azospirillum brasilense FP2 e do peptídeo soyuretox, derivado da urease ubíqua de soja (Glycine max)

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae.Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae

Estudo da estabilidade dos peptideos derivados da urease de Canavalia ensiformis: Jaburetox-2Ec e Jaburetox-V5

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Clonagem e expressão da urease da bactéria diazotrófica Azospirillum brasilense FP2 e do peptídeo soyuretox, derivado da urease ubíqua de soja (Glycine max)

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae.Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae

Estudos com o jaburetox : efeito tóxico de e. coli liofilizadas carregadas com o peptídeo e análise da influência do epitopo v5 na formação de agregados

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa contra predadores e patógenos em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease de Canavalia ensiformis. Essa toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa, o Pepcanatox, que é liberado pela hidrólise da proteína por enzimas digestivas do tipo-catepsinas dos insetos suscetíveis. Baseado no sequência N-terminal do Pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente ao pepcanatox foi clonado e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo denominado Jaburetox-2Ec, fusionado com um epitopo V5 e seis histidinas na região C-terminal foi testado contra insetos e causou 100% de mortalidade em modelos como Dysdercus peruvianus, e Spodoptera frugiperda após a ingestão de microgramas do peptídeo purificado. A fim de retirar o epitopo V5 da sequência do peptídeo, a sequência de DNA do Jaburetox-2Ec foi reamplificado por PCR, clonado em plasmídeo pET23a obtendo o peptídeo adicionado apenas da cauda de seis histidinas, o Jaburetox-V5. Nesse trabalho foi testada a atividade inseticida de E. coli liofilizadas, carregadas com o Jaburetox-V5, contra insetos modelo que se mostraram suscetíveis ao Jaburetox-2Ec (D. peruvianos e S. frugiperda), bem como contra o Aedes aegypti. Além disso, foi analisado se o epitopo V5 influencia na agregação do peptídeo purificado, pela comparação entre o Jaburetox-2Ec e Jaburetox-V5 por SDS-PAGE a 15% durante 4 semanas, com os peptídeos armazenados em diferentes tampões e em duas temperaturas, 4°C e -20°C. Os resultados demonstraram letalidade do peptídeo acumulado na célula bacteriana liofilizadas apenas contra o mosquito A. aegypti e que há influência do epitopo V5 no processo de agregação dos peptídeos

Estudos com o jaburetox : efeito tóxico de e. coli liofilizadas carregadas com o peptídeo e análise da influência do epitopo v5 na formação de agregados

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa contra predadores e patógenos em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease de Canavalia ensiformis. Essa toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa, o Pepcanatox, que é liberado pela hidrólise da proteína por enzimas digestivas do tipo-catepsinas dos insetos suscetíveis. Baseado no sequência N-terminal do Pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente ao pepcanatox foi clonado e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo denominado Jaburetox-2Ec, fusionado com um epitopo V5 e seis histidinas na região C-terminal foi testado contra insetos e causou 100% de mortalidade em modelos como Dysdercus peruvianus, e Spodoptera frugiperda após a ingestão de microgramas do peptídeo purificado. A fim de retirar o epitopo V5 da sequência do peptídeo, a sequência de DNA do Jaburetox-2Ec foi reamplificado por PCR, clonado em plasmídeo pET23a obtendo o peptídeo adicionado apenas da cauda de seis histidinas, o Jaburetox-V5. Nesse trabalho foi testada a atividade inseticida de E. coli liofilizadas, carregadas com o Jaburetox-V5, contra insetos modelo que se mostraram suscetíveis ao Jaburetox-2Ec (D. peruvianos e S. frugiperda), bem como contra o Aedes aegypti. Além disso, foi analisado se o epitopo V5 influencia na agregação do peptídeo purificado, pela comparação entre o Jaburetox-2Ec e Jaburetox-V5 por SDS-PAGE a 15% durante 4 semanas, com os peptídeos armazenados em diferentes tampões e em duas temperaturas, 4°C e -20°C. Os resultados demonstraram letalidade do peptídeo acumulado na célula bacteriana liofilizadas apenas contra o mosquito A. aegypti e que há influência do epitopo V5 no processo de agregação dos peptídeos

Estudo da estabilidade dos peptideos derivados da urease de Canavalia ensiformis: Jaburetox-2Ec e Jaburetox-V5

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