Functional Characterization of MutS Homologue Mismatch Repair Proteins and their Variants

Lynch syndrome (LS) is one of the most common hereditary cancer syndromes and may lead to cancer development, mainly in colon or in endometrium, for 20 years earlier than in general population. LS is an autosomal dominantly inherited disorder, associated with the malfunction of a highly conserved postreplicative DNA mismatch repair (MMR) mechanism and germline mutations at least in four different MMR genes, MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2. The MMR genes MSH3 and MLH3 have also been linked to LS but their roles are less clear. To be able to offer an appropriate follow-up and genetic counseling to LS families and their mutation carriers, they must be diagnosed, which usually starts by studying the cancer history in the family and the tumor phenotype of the index patient followed by mutation search and pathogenicity assessment of found variations. The amino acid changes which change only one amino acid in a protein structure, do not necessarily destroy protein and therefore their pathogenicity is difficult to interpret. Furthermore, in rare cases, an individual can carry two variations either in the same or different MMR genes, which further complicates the pathogenicity assessment. DNA MMR corrects mismatches arising mainly during DNA replication. DNA synthesis in each cell division is carried out by three major replicative DNA polymerases (Pols) α, δ and ε and their incomplete proofreading activity together with malfunction in MMR leads to the accumulation of mismatches in the genome leading to genomic instability and cancer. MutS homologue (MSH) MMR proteins form the DNA mismatch recognizing factors MutSα (MSH2/MSH6) and MutSβ (MSH2/MSH3). One aim in the present study was to analyze the substrate efficiencies of MutSα and MutSβ by using the functional in vitro MMR assay with different substrates and cell lines. The target substrates of MutSα and MutSβ have already been widely studied. However, the extent of their functional redundancy and clinical substance remains unclear. Here, our results show that although MutSα alone seems to be responsible for the mismatch and one nucleotide loop repair, MutSα and MutSβ have functional redundancy in two nucleotide loop repair and MutSβ even seems to exceed MutSα in that. The finding is clinically relevant since such a strong role in two nucleotide loop repair indicates MSH3 deficiency in tumors with low dinucleotide and no mononucleotide repeat instability. The second aim in the study was to functionally characterize a possible compound effect of 9 pairs of variants of unknown significance (VUS) found in cancer patients. Four variant pairs were shown to be proficient while one VUS, MSH2 c.380A>G was individually assessed proficient but in a pair with another VUS deficient. Thus, our results suggest that two inherited MMR gene variations in a cancer patient may have a concomitant contribution to MMR deficiency. Moreover, the role of this frequently reported MMR gene VUS MSH2 c.380A>G is especially interesting, since its concomitant defect with another variant could finally explain its recurrent occurrence in colorectal cancer patients. Three MSH6 VUS were shown to cause MMR deficiency individually. Furthermore, one separately studied MSH3 variation was shown to be proficient in MMR. The third aim was to study the role of replicative polymerases α and ε in MMR. Here, we demonstrate a proliferating cell nuclear antigen independent interaction between replicative DNA polymerases and MSH proteins MSH2 and MSH6 by co-purification as well as by conventional and chromatin immunoprecipitation. Chromatin recruitment but not the release of MSH2 appears to depend on DNA replication. The novel interaction provides a potential mechanism for replication-dependent strand discrimination during MMR. In addition, we showed that polymerases of the replication fork have a functional role in human MMR. Our data, suggesting that MSH2 and MSH6 physically interact with Pols δ and Pol α, are in accordance with models where MSH proteins are continuously loaded onto chromatin in a replication-dependent manner and persist on DNA that has already completed replication.Lynchin syndrooma (LS) on yksi yleisimmistä periytyvistä syöpätaudeista ja se altistaa syövän kehittymiselle pääasiassa paksusuoleen tai kohdun limakalvolle. Periytyvä syöpä todetaan noin keskimäärin 20-vuotta aikaisemmin kuin vastaavat sporadiset syövät. LS periytyy autosomaalisesti dominantisti, ja se on yhdistetty konservoituneen DNA-virheitä korjaavan mismatch repair (MMR) -korjausjärjestelmän toimintahäiriöön sekä LS:lle altistaviin ituradan mutaatioihin ainakin neljässä eri MMR geenissä: MLH1, MSH2, MSH6 ja PMS2. Myös MMR geenit MSH3 ja MLH3 on yhdistetty Lynchin syndroomaan, mutta niiden rooli siinä on vielä epäselvä. Lynchin syndroomaperheille ja mutaationkantajille tarjottavan geneettisen neuvonnan ja seurannan edellytyksenä on taudin toteaminen. Diagnosointi aloitetaan tutkimalla suvun syöpähistoriaa ja potilaiden kasvainten ilmiasua, minkä jälkeen mutaatioita etsitään potilailta ja mahdollisesti löytyneen variaation patogeenisuus pyritään arvioimaan. Aminohappomuutokset, jotka muuttavat vain yhden aminohapon proteiinien rakenteessa, eivät välttämättä muuta proteiinin toimintaa merkittävästi, mikä vaikeuttaa variaation patogeenisuuden tulkintaa. Lisäksi harvoissa tapauksissa, joissa yksilö kantaa kahta eri variaatiota, joko samassa tai eri MMR-geenissä, patogeenisuuden arviointi on erityisen haastavaa. MMR-korjausmekanismi korjaa emäspariutumavirheitä, jotka syntyvät DNA:n kahdentumisen yhteydessä. Solun jakautuessa DNA:n synteesi tapahtuu kolmen replikatiivisen polymeraasin (pol) α, δ ja ε toimesta. Polymeraasien epätäydellinen oikoluku yhdistettynä MMR -korjausjärjestelmän toimintahäiriöön, johtaa DNA-virheiden kerääntymiseen genomiin, mikä aiheuttaa genomin epävakautta ja voi johtaa syövän kehittymiseen. MMR-proteiinien MutS-homologit muodostavat emäspariutumavirheitä tunnistavat MutSα (MSH2/MSH6) ja MutSβ (MSH2/MSH3) -heterodimeerikompleksit. Yksi työn tavoitteista oli analysoida MutSα- ja MutSβ-proteiinikompleksien korjaustehokkuutta erityyppisissä emäspariutumavirheissä käyttäen hyväksi toiminnallista in vitro MMR testiä. Vaikka MutSα- ja MutSβ-kompleksien kohteena olevia substraatteja on tutkittu paljon, on niiden rooli korjauksessa ja sen kliininen merkitys on vielä epäselvä. Työn tulokset osoittavat, että MutSα näyttäisi olevan yksinään vastuussa GT-emäsparivirheiden ja yhden nukleotidin silmukkarakenteiden korjauksesta, mutta MutSα ja MutSβ -heterodimeerikomplekseilla on toiminnallinen päällekkäisyys kahden nukleotidin silmukkarakenteen korjauksessa, jossa MutSβ näyttäisi olevan tehokkaampi kun MutSα. Löydös on kliinisesti merkittävä, koska MutSβ:n vahva rooli kahden nukleotidin silmukoiden korjauksessa indikoi MSH3-proteiinin toimimattomuutta kasvaimissa, joissa on vain vähäistä dinukleotiditoistojaksojen epävakautta, mutta vakaat mononukleotiditoistojaksot. Työn toisena tavoitteena oli toiminnallisesti karakterisoida syöpäpotilailta löytyneiden 9 erilaisen variaatioparin mahdollista yhteisvaikutusta. Neljän tutkitun variaatioparin ei todettu vaikuttavan proteiinien korjauskykyyn. MSH2-variaation c.380A>G, joka ei yksinään esiintyessään vaikuttanut korjauskykyyn, havaittiin yhdessä toisen variaation kanssa aiheuttavan tilastollisesti merkitsevän korjauskyvyn aleneman. Työn tulokset viittaavat siihen, että kaksi perittyä MMR-geenivariaatiota syöpäpotilaalla saattavat yhdessä aiheuttaa puutoksen MMR korjauksessa. Lisäksi usein raportoidun MSH2 c.380A>G MMR-geenivariaation rooli on erityisen kiinnostava, koska sen havaittu yhteisvaikutus toisen variaation kanssa saattaa vihdoin selittää sen, miksi sitä tavataan toistuvasti paksusuolisyöpäpotilailla. Kolmessa tutkitusta parista MMR-korjauksen puutteen todettiin johtuvan yksittäisestä patogeenisesta MSH6-variaatiosta. Työssä tutkittu MSH3 geenin variaatio ei vaikuttanut MMR-korjaukseen. Työn kolmas tavoite oli tutkia replikatiivisten polymeraasien α ja ε osuutta MMR-mekanismissa. Työssä osoitettiin, että MSH-proteiinit ovat suorassa vuorovaikutuksessa replikatiiviset polymeraasien kanssa eikä PCNA (proliferating cell nuclear antigen) toimi näiden vuorovaikutusten välittäjänä, kuten aikaisemmin on arveltu. DNA:n replikaatio näyttää vaikuttavan MSH2:n kromatiiniin liittymiseen, mutta ei sen irtoamiseen siitä. Lisäksi työssä osoitettiin, että polymeraaseilla α ja ε on toiminnallinen rooli MMR-korjauksessa. Tulosten perusteella voidaan sanoa, että malli, jossa MSH2 interaktoi fyysisesti pol δ:n kanssa ja MSH6 taas pol α:n kanssa, sopii aiemmin julkaistuun havaintoon, että MSH proteiineja liitetään jatkuvasti kromatiiniin replikaation aikana, mutta ne pysyvät sitoutuneena jo kahdentuneessa DNA:ssa

Tumor-independent Detection of Inherited Mismatch Repair Deficiency for the Diagnosis of Lynch Syndrome with High Specificity and Sensitivity

Lynch syndrome (LS) is the most common hereditary cancer syndrome. Early diagnosis improves prognosis and reduces health care costs, through existing cancer surveillance methods. The problem is finding and diagnosing the cancer predisposing genetic condition. The current workup involves a complex array of tests that combines family cancer history and clinical phenotypes with tumor characteristics and sequencing data, followed by a challenging task to interpret the found variant(s). On the basis of the knowledge that an inherited mismatch repair (MMR) deficiency is a hallmark of LS, we have developed and validated a functional MMR test, DiagMMR, that detects inherited MMR deficiency directly from healthy tissue without need of tumor and variant information. The validation included 119 skin biopsies collected from clinically pathogenic MMR variant carriers (MSH2, MSH6) and controls, and was followed by a small clinical pilot study. The repair reaction was performed on proteins extracted from primary fibroblasts and the interpretation was based on the MMR capability of the sample in relation to cutoff, which distinguishes MMR proficient (non-LS) from MMR deficient (LS) function. The results were compared with the reference standard (germline NGS). The test was shown to have exceptional specificity (100%) with high sensitivity (89%) and accuracy (97%). The ability to efficiently distinguish LS carriers from controls was further shown with a high area under the receiving operating characteristic (AUROC) value (0.97). This test offers an excellent tool for detecting inherited MMR deficiency linked to MSH2 or MSH6 and can be used alone or with conventional tests to recognize genetically predisposed individuals.Clinical validation of DiagMMR shows high accuracy in distinguishing individuals with hereditary MSH2 or MSH6 MMR deficiency (i.e., LS). The method presented overcomes challenges faced by the complexity of current methods and can be used alone or with conventional tests to improve the ability to recognize genetically predisposed individuals.Peer reviewe