Silkworm expression system as a platform technology in life science

Many recombinant proteins have been successfully produced in silkworm larvae or pupae and used for academic and industrial purposes. Several recombinant proteins produced by silkworms have already been commercialized. However, construction of a recombinant baculovirus containing a gene of interest requires tedious and troublesome steps and takes a long time (3–6 months). The recent development of a bacmid, Escherichia coli and Bombyx mori shuttle vector, has eliminated the conventional tedious procedures required to identify and isolate recombinant viruses. Several technical improvements, including a cysteine protease or chitinase deletion bacmid and chaperone-assisted expression and coexpression, have led to significantly increased protein yields and reduced costs for large-scale production. Terminal N-acetyl glucosamine and galactose residues were found in the N-glycan structures produced by silkworms, which are different from those generated by insect cells. Genomic elucidation of silkworm has opened a new chapter in utilization of silkworm. Transgenic silkworm technology provides a stable production of recombinant protein. Baculovirus surface display expression is one of the low-cost approaches toward silkworm larvae-derived recombinant subunit vaccines. The expression of pharmaceutically relevant proteins, including cell/viral surface proteins, membrane proteins, and guanine nucleotide-binding protein (G protein) coupled receptors, using silkworm larvae or cocoons has become very attractive. Silkworm biotechnology is an innovative and easy approach to achieve high protein expression levels and is a very promising platform technology in the field of life science. Like the “Silkroad,” we expect that the “Bioroad” from Asia to Europe will be established by the silkworm expression system

Molecular Basis for Herpesvirus Entry Mediator Recognition by the Human Immune Inhibitory Receptor CD160 and Its Relationship to the Cosignaling Molecules BTLA and LIGHT

CD160 was recently identified as a T cell coinhibitory molecule that interacts with the herpesvirus entry mediator (HVEM) on antigen-presenting cells to deliver a potent inhibitory signal to CD4+ T cells. HVEM also binds to the coinhibitory receptor BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator) and the costimulatory receptor LIGHT (which is homologous to lymphotoxins, exhibits inducible expression, and competes with the herpes simplex virus glycoprotein D for HVEM, a receptor expressed by T lymphocytes, or TNFSF14), thus regulating the CD160/BTLA/LIGHT/HVEM signaling pathway. To date, the detailed properties of the formation of these complexes, especially HVEM binding to the newly identified receptor CD160, and the relationship of CD160 with BTLA and LIGHT are still unclear. We performed N-terminal sequencing and a mass spectrometric analysis, which revealed that the extracellular domain of CD160 exists primarily in the monomeric form. The surface plasmon resonance (SPR) analysis revealed that CD160 binds directly to the cysteine-rich domain (CRD) 1-3 of HVEM with a similar affinity to, but slower dissociation rate than, that of BTLA. Notably, CD160 competed with BTLA for binding to HVEM, in contrast, LIGHT did not affect HVEM binding to either CD160 or BTLA. The results of a mutagenesis study of HVEM also suggest that the CD160 binding region on HVEM was slightly different than, but overlapped with, the BTLA binding site. Interestingly, an anti-CD160 antibody exhibiting antiangiogenic properties blocked CD160-HVEM binding. These results provide insight into the molecular architecture of the CD160/BTLA/LIGHT/HVEM signaling complex that regulates immune function

マウスMHCクラスI様分子MILLの生化学的解析

主要組織適合性遺伝子複合体（major histocompatibility complex; MHC）は、皮膚移植片の生着を支配する分子（移植抗原）をコードする遺伝領域として発見された。ヒトでは6 番染色体のHLA 領域、マウスでは17 番染色体のH2 領域がこれに相当する。その後、移植抗原の生理的機能は、抗原ペプチドをＴ細胞レセプターに提示することにあることが判明し、今日では、これらの抗原はMHC クラスI 分子およびMHC クラスII 分子として広く知られるにいたっている。ヒトではHLA-A/B/C 分子、マウスではH2-K/D/L 分子がMHC クラスI 分子に相当する。MHC クラスI 分子には多くの類似分子が存在するため、これらは他のMHC クラスI 様分子と区別して、特にMHC クラスIa 分子と呼ばれている。MHC クラスIa 分子はペプチドおよびβ2 ミクログロブリンと結合する膜表面局在型の糖タンパク質であり、細胞質内タンパク質由来のペプチドのCD8+T 細胞への提示が主な機能である。 MHC クラスIa 分子以外のクラスＩ分子はMHC クラスIb 分子と呼ばれている。ヒトでもマウスでも、MHC クラスI 様分子の中でのMHC クラスIa 分子の種類は少数であり、大部分はMHC クラスIb 分子である。MHC クラスIb 分子は、一部の例外を除けば、MHC クラスIa 分子と同様にβ2 ミクログロブリンと結合する膜表面局在型の糖タンパク質であり、その立体構造もMHC クラスIa 分子と似たフォールドを形成している。ただし、結合する低分子は必ずしもペプチドではなく、例えば糖脂質を結合するMHC クラスIb 分子も存在する。さらに、リガンドがまったく結合していないと考えられるMHC クラスIb 分子も存在する。したがって、MHC クラスIb 分子の機能はペプチドの提示にとどまらず多様である。これらMHC クラスIb ファミリーの多彩な機能は、１）特殊な抗原提示を行なうもの、２）抗原提示以外の免疫機能を持っているもの、３）免疫系以外で機能するものに大別される。 最近、Kasahara らはこれまでに知られているMHC クラスIb のいずれとも異なるMHC クラスIb ファミリー遺伝子をマウスで（後にラットでも）発見した。この遺伝子はマウス7 番染色体上の白血球受容体複合体（leukocyte receptor complex; LRC）領域近傍でコードされることからMill（MHC Class I-like located near the LRC）と命名された。Mill はMill1 およびMill2 の二つからなるファミリーで、多型が少なく、その遺伝子産物であるMILL1 およびMILL2 の生体組織における発現量は低いと考えられている。RT-PCR 解析によればMill1 は胸腺や新生児の皮膚といった限られた組織で転写されているが、Mill2 はほとんどの組織で低いレベルで転写されている。遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列からは、MILL1 およびMILL2 はMHC クラスIa 分子と同様に三つの細胞外ドメイン (α1 からα3)からなる糖タンパク質であると推測された。しかしながらα1 ドメインおよびα2 ドメインの、ペプチドとの相互作用に重要な部位が欠落していることも推測され、MILL はペプチドを結合しないことが示唆された。また、MILL1 とMILL2 の配列は、既知のMHC クラスI ファミリーの中ではMICA/Bに最も近く、げっ歯類にMICA/B ファミリーは存在せず、一方ヒトにはMill ファミリー遺伝子が存在しないことから、MILL はMICA/B の機能的対応分子ではないかと推測されていた。MICA/B はナチュラルキラー（natural killer; NK）細胞受容体NKG2Dのリガンドとして、NK 細胞を活性化する分子である。しかしながら、マウスではRAE-1およびH60 がMICA/B と同様にNKG2D のリガンドとして機能するため、MILL はMICA/B の機能的対応分子ではなく、別の機能をもっている可能性も考えられた。 本研究においては、MILL 分子の生化学的特性を明らかにすべく、主としてマウス培養細胞株で発現させた組換えMILL 分子を用いて詳細な解析を行った。その結果、MILL1 およびMILL2 がβ2 ミクログロブリンと相互作用する、グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol; GPI）アンカー型の糖タンパク質であることを明らかにした。また、MILL 分子の細胞表面発現はTAP 機能に依存しないことを明らかにした。後者の結果はMILL1 およびMILL2 が抗原ペプチドを結合しないことを示唆するものであった。MILL1、MILL2 はβ2 ミクログロブリンと相互作用すること、GPI で細胞膜に結合していることなどの点で、MICA/B と異なっており、両者は生化学的特性を異にするMHC クラスIb 分子であることが示された。 さらに、マウスMILL 分子を大腸菌の封入体として作成し、β2 ミクログロブリンを加えることにより、同分子を巻き戻すことに成功した。この成果は、立体構造解析を含め、MILL 分子の詳細なタンパク質構造解析に道を拓くものである

The efficient detection of membrane protein with immunoblotting: lessons from cold-temperature denaturation

　Transmembrane proteins play essential roles in cell signaling, transport of membrane-impermeable molecules, cell-cell communication, and cell adhesion. Our recent work demonstrated that reactive oxygen species-generating NADPH oxidase 4 (Nox4), a protein with multiple transmembrane domains, is involved in cell migration by stabilizing vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), a single-span transmembrane protein. During this study and with further verification, we developed a simple method to prepare protein samples without aggregating these membrane proteins for SDS-PAGE, immunoblotting, and deglycosylation assay. We found that heating was unnecessary for protein denaturation for SDS-PAGE and deglycosylation assay. Also, the detectable amounts of VEGFR-2 and Nox4 were increased in the sample treated at 4℃ compared with the sample treated at 98℃ . Moreover, the N-glycan of VEGFR-2 was digested by glycosidase at reaction temperature 4℃