Caractérisation moléculaire et phylogénétique de l’enveloppe du VIH-1 transmis/fondateur

Vaincre efficacement l’infection par le VIH nécessite non seulement de raffiner davantage les traitements antirétroviraux, mais aussi de déployer des moyens de prévention à large échelle afin de stopper la propagation de la maladie. Il s’agit en effet de pouvoir développer un vaccin préventif ou thérapeutique à large spectre. L’atteindre de cet objectif requiert une meilleure compréhension des événements précoces médiés par les glycoprotéines d'enveloppe des virus transmis/fondateurs du VIH développés durant la primo-infection. Pendant que les efforts de la communauté scientifique se concentrent à trouver ce vaccin, il est également nécessaire de limiter le taux des nouvelles infections dans la population. Les résultats de nos travaux présentés dans cette thèse s’inscrivent dans cette optique de prévention des infections à VIH par l’étude de la dynamique de transmission de la maladie. Le premier volet de nos travaux dont les résultats sont consignés dans ce document et publiés dans le journal « PLOS ONE » (Chapitre III. Article 1) porte le titre : « Identification des nouvelles infections par le VIH-1 en utilisant des mesures de la diversité génétique des séquences de l’enveloppe ». L’objectif de cette étude était d’évaluer et de déterminer quelle méthode moléculaire parmi les mesures de diversité génétique de la séquence de l'enveloppe est capable de définir l’infection par le VIH-1 temporellement (récente versus chronique). Quatre mesures de diversité génétique des séquences virales de courts segments de l’enveloppe du VIH-1 ont été évaluées pour définir l’infection par le VIH-1 temporellement à savoir: le pourcentage de complexité, le pourcentage de diversité, le nombre d’haplotypes et l’entropie de Shannon. Nous avons identifié l'entropie de Shannon comme l'une des meilleures de ces quatre mesures de diversité qui associée à trois courts segments (≤100 paires de bases) de la séquence de l'enveloppe du VIH-1 est capable de prédire efficacement la période récente de l’infection par le VIH-1. L’indice de performance de l’entropie de Shannon (Aire sous la courbe (AUC) des trois segments de l’enveloppe du VIH-1 que sont : (1) région constante C2 segment 1 (C2_1), (2) région constante C2 segment 3 (C2_3) et (3) boucle V3 de la gp120 est respectivement de 0.806, 0.805 et 0.812. La capacité de différencier une infection récente d'une infection ancienne est importante en santé publique. En effet, les personnes nouvellement infectées sont les plus infectieuses et capables de propager rapidement la maladie dans la population. Puisque ces personnes ignorent leur statut sérologique, elles peuvent avoir plus de comportements à risque alors qu’elles ont une charge virale sanguine élevée d’un virus avec une capacité réplicative assez importante (fitness). Pouvoir identifier le plus tôt possible ces individus permettrait de limiter et de prévenir les nouvelles transmissions. Le deuxième volet de nos travaux consignés dans cette thèse (Chapitre III, Article 2) a été publié dans le journal « AIDS Research and Human Retroviruses » avec pour titre : « Analyses phylogénétiques des séquences du gène de l’enveloppe du VIH-1 pour l’évaluation et la construction à court terme des réseaux naissants de la transmission de l’infection par le VIH-1 ». Cette étude a consisté à identifier les liens phylogénétiques ou clusters qui existent entre les séquences virales de l’enveloppe du VIH-1 de patients nouvellement diagnostiqués au Québec. La formation de clusters entre les séquences virales de plusieurs individus pourrait refléter l'appartenance de ces personnes à un même réseau ou chaine de transmission. Ces personnes pourraient aussi partager des caractéristiques ou facteurs de risques communs au groupe. Les résultats de cette étude ont permis d’identifier 15 chaines ou réseaux de transmission mineurs (2-5 individus par réseau) de l’infection par le VIH-1 entre ces individus. Nous avons également évalué et comparé la capacité d’un fragment d’une séquence nucléotidique plus large de l’enveloppe du VIH-1 à celui de la boucle V3 beaucoup plus courte à pouvoir prédire et identifier de façon indépendante les individus qui pourraient être inclus dans un réseau ou grappe de transmission. Les résultats de nos analyses ont démontré une concordance modérée en se basant sur le coefficient kappa (k=0.59) entre les deux fragments de l'enveloppe virale utilisés. L’utilisation des séquences de la boucle V3 a en effet permis de confirmer 66.70% (10/15) des clusters identifiés avec un fragment plus long de la séquence de l’enveloppe du VIH-1. Le nombre de personnes infectées ayant accès aux tests de génotypage qui utilisent les séquences de la V3 pour déterminer le tropisme viral en pratique clinique courante est limité à l’échelle mondiale. Cependant, les séquences de l’enveloppe virale et particulièrement celles de la boucle V3 pourraient facilement être intégrées dans un programme de santé publique là où elles sont disponibles en complément de celles du gène pol (disponibles dans les laboratoires cliniques dans le cadre des tests de résistance aux traitements antirétroviraux) pour l’identification et la surveillance des réseaux de transmission du VIH-1 dans la population. Nous avons inclus les caractéristiques des sujets (données sociodémographiques, cliniques et facteurs de risque) dans un modèle d’analyse de régression logistique avec comme variable réponse (outcome) la formation de clusters de transmission. Les résultats de l'analyse démontrent que dans la population étudiée, l'âge moyen (<38.8 versus ≥38.8 ans) et le sous-type viral (sous type B versus non-B) sont deux facteurs significativement associés à la formation des clusters ou réseaux. L’identification des chaines de transmission du VIH-1 dans un échantillon de la population infectée par le VIH-1 au Québec et les facteurs de risques communs à ces personnes devraient permettre de mieux implanter les stratégies de prévention dans les groupes cibles. Les résultats de la troisième et dernière partie de nos travaux présentée dans cette thèse (Chapitre III, Article 3) ont été publiés dans le Journal « VIRUSES » sous le titre : « Identification de signatures génétiques au niveau de la glycoprotéine de l’enveloppe du VIH-1 associées aux virus transmis/fondateurs et récents de sous-types B ». Cette étude a consisté à identifier des signatures génétiques au niveau des séquences virales de l’enveloppe des premiers variants du VIH-1 appelés virus transmis/fondateurs ou « Transmitted/Founder viruses ». Ces variants constituent ceux qui sont capables d’établir une infection productive au moment de l'infection. Ils sont en effet sélectionnés parmi une multitude de quasi-espèces virales exposées au cours de la transmission du virus. Ils détiennent ainsi toutes les propriétés phénotypiques et ou fonctionnelles nécessaires à l’établissement de l’infection. L’identification de signatures génétiques observées précocement au niveau de la glycoprotéine de l’enveloppe du VIH-1 au cours de l’infection pourrait informer la conception de nouveaux inhibiteurs d’entrée immunologiques ou chimiques, mais aussi servir de repère pour le design d’un vaccin anti-VIH-1. Nos travaux ont permis d’identifier quelques signatures génétiques, mais une consistant en une mutation/substitution de l'Arginine (R) par une Isoleucine (I) associée au virus TF semble être particulièrement prononcée. Cette mutation est localisée à la position 841 (R841I) spécifiquement dans le domaine cytoplasmique de la GP41 notamment dans le segment 1 des peptides lytiques de lentivirus (LLP-1). L’isoleucine est sélectionnée (I) à plus de 33% par les virus TF comparativement aux virus d’infections chroniques (9%) et la différence est statistiquement significative, OR=0.2, 95% IC [0.09, 0.44], P= 0.00001. Le domaine cytoplasmique de la GP41 et spécifiquement le LLP-1 est fortement impliqué dans la réplication virale en intervenant dans le trafic intracellulaire et l’incorporation des glycoprotéines de l'enveloppe dans les virions. Une mutation dans ce domaine pourrait être un mécanisme moléculaire (polymorphisme) nécessaire à l’établissement de la transmission et d’échappement à la réponse immunitaire.Overcoming HIV infection effectively requires further refinement of antiretroviral therapy as well as intensifying prevention strategies to stop the spread of the disease. It involves the capacity to develop a preventive or therapeutic broad-spectrum vaccine. Reaching this goal requires a better understanding of the acute and early events mediated by HIV founder viruses’ envelope glycoproteins during primary infection. While efforts of the scientific community are focused on finding a preventive vaccine, it is also necessary to limit the rate of new infections in the population. This thesis contributes to the efforts focusing on HIV prevention by studying the transmission dynamics of disease transmission and progression. The first part of my work is detailed in Chapter III and presented in a manuscript published in the journal “PLOS ONE” bears the title: « HIV-1 envelope sequence-based measures for identifying recent infections » (Article 1). The objective of this study was to evaluate and determine which molecular method, among envelope genetic diversity measures, can qualify the current status of HIV-1 infection. Four genetic diversity measures of short segments of HIV-1 envelope sequences were evaluated for their efficacy to characterize infection recency. They included i) the percent complexity, ii) the percent of diversity, iii) the number of haplotypes and iv), the Shannon entropy. We have identified Shannon entropy as the best diversity measure which can effectively predict the recency of HIV-1 infection when associated to three short segments (less than 100 base pairs) of the HIV-1 envelope gp120 C2 segments 1 and 3 and the V3 loop as envelopes sequenced based diversity measure (s) and segments. The performance index of Shannon entropy for these 3 segments: gp120 C2 segment 1; C2 segment 3; V3 loop was 0,806, 0, 0805, and 0,812 respectively. It could serve as a molecular biomarker for identifying new infections in newly diagnosed HIV-1-positive patients. The ability to differentiate recent infections from established (chronic) infections is important for public health. In fact, newly infected people are the most infectious and able to spread the disease quickly in the population. Since these people are usually unaware of their HIV status, they may engage in risky behaviours. This population generally has a high viral load with a relatively high-replicating capacity (fitness) that accelerates HIV-1 forward transmission. Being able to identify these individuals as soon as possible could limit and prevent new transmissions. Our work demonstrated that Shannon entropy measuring of these nucleic sequences can identify new infections. The second part of my work is reported in Chapter III and published in the journal « AIDS Research and Human Retroviruses » entitled: « A short-term assessment of HIV-1 transmission dynamics among newly diagnosed individuals using envelope sequence-based phylogenetic clustering » (Article 2). This study consists of identifying the phylogenetic links or clusters that exist between the viral sequences of the HIV-1 envelope of newly diagnosed patients in Québec. The formation of clusters between the viral sequences of several individuals could reflect the relationship of transmitted viruses between individuals who might share characteristics or commons risk factors. The results of this study identified 15 minor transmission clusters (2-5 individuals per cluster) between study participants. We also assessed and compared the ability of a fragment of a larger nucleotide sequence of the HIV-1 envelope to that of the much shorter V3 loop to independently predict and identify individuals that might be included in a transmission cluster. They demonstrated a moderate agreement based on the kappa coefficient (k= 0.59) between the two fragments of the viral envelope used. The use of the V3 loop sequences indeed confirmed 66.70% (10/15) of the identified clusters with a longer fragment of the HIV-1 envelope sequence. The number of infected individuals accessing genotyping tests that use V3 sequence to determine viral tropism in routine clinical practice is globally limited. However, the sequences of the viral envelope and particularly those of the V3 loop could easily be integrated into a public health program where they could be available in addition to those of the pol genes (available in clinical laboratories for antiretroviral resistance testing). We also included the characteristics of the subjects (sociodemographic, clinical and risk factors) in a logistic regression analysis model with cluster formation as an outcome). The results of the analysis demonstrate that in the study population, the average age (38.8 years) and the viral subtype (subtype B versus non-B) are two factors significantly associated with HIV transmission clustering among participants. Underlying HIV-1 transmission chains among HIV-1+ individuals in Québec and identifying the common risk factors should help the efforts to implement better prevention strategies in the target groups. The results of the third and last part of this work reported in this thesis (Chapter III, Article 3), were published in « VIRUSES » journal entitled: « HIV-1 Envelope Glycoprotein Amino Acids Signatures Associated with Clade B Transmitted/Founder and Recent Viruses ». It consists in identifying genetic signatures in the viral envelope sequences of the first HIV-1 variants called Transmitted/Founder (TF) viruses selected during the acute stage of infection. These variants can establish a productive infection at the time of infection in the new host. They are indeed selected among a multitude of viral quasi-species exposed during virus transmission. They may possess molecular and phenotypic properties that may govern their functions of the successful establishment of infection. Identifying such early HIV-1 genetic signatures may inform the design of novel immunologic or chemical inhibitors and serve as a benchmark for designing an effective HIV-1 vaccine. This study identified a few genetic signatures among HIV-1 TF viruses’ envelope amino acid sequences. One of these signatures consisting of a mutation/substitution of an arginine (R) by an isoleucine (I) associated with TF virus seems to be particularly important. This mutation is located at position 841 (R841I) specifically in the cytoplasmic domain of gp41 in segment 1 of lentivirus lytic peptides (LLP-1). The isoleucine is selected at more than 33% by TF viruses compared to chronic infection viruses (9%). The difference of selected amino acid between the two types of infectious viruses is statistically significant, OR = 0.2, 95% CI [0.09, 0.44], p = 0.00001. The cytoplasmic domain of GP41 and specifically the LLP-1 is strongly implicated in viral replication by mediating intracellular trafficking and the envelope incorporation into virions. A mutation in this area may suggest a molecular mechanism (polymorphism) contributing to HIV-1 transmission and/or viral escape from immune response

A short-term assessment of nascent HIV-1 transmission clusters among newly diagnosed individuals using envelope sequence-based phylogenetic analyses

The identification of transmission clusters (TCs) of HIV-1 using phylogenetic analyses can provide insights into viral transmission network and help improve prevention strategies. We compared the use of partial HIV-1 envelope fragment of 1,070 bp with its loop 3 (108 bp) to determine its utility in inferring HIV-1 transmission clustering. Serum samples of recently (n = 106) and chronically (n = 156) HIV-1-infected patients with status confirmed were sequenced. HIV-1 envelope nucleotide-based phylogenetic analyses were used to infer HIV-1 TCs. Those were constructed using ClusterPickerGUI_1.2.3 considering a pairwise genetic distance of £10% threshold. Logistic regression analyses were used to examine the relationship between the demographic factors that were likely associated with HIV-1 clustering. Ninety-eight distinct consensus envelope sequences were subjected to phylogenetic analyses. Using a partial envelope fragment sequence, 42 sequences were grouped into 15 distinct small TCs while the V3 loop reproduces 10 clusters. The agreement between the partial envelope and the V3 loop fragments was significantly moderate with a Cohen’s kappa (j) coefficient of 0.59, p < .00001. The mean age (<38.8 years) and HIV-1 B subtype are two factors identified that were significantly associated with HIV-1 transmission clustering in the cohort, odds ratio (OR) = 0.25, 95% confidence interval (CI, 0.04–0.66), p = .002 and OR: 0.17, 95% CI (0.10–0.61), p = .011, respectively. The present study confirms that a partial fragment of the HIV-1 envelope sequence is a better predictor of transmission clustering. However, the loop 3 segment may be useful in screening purposes and may be more amenable to integration in surveillance programs

HIV-1 envelope sequence-based diversity measures for identifying recent infections

Identifying recent HIV-1 infections is crucial for monitoring HIV-1 incidence and optimizing public health prevention efforts. To identify recent HIV-1 infections, we evaluated and compared the performance of 4 sequence-based diversity measures including percent diversity, percent complexity, Shannon entropy and number of haplotypes targeting 13 genetic segments within the env gene of HIV-1. A total of 597 diagnostic samples obtained in 2013 and 2015 from recently and chronically HIV-1 infected individuals were selected. From the selected samples, 249 (134 from recent versus 115 from chronic infections) env coding regions, including V1-C5 of gp120 and the gp41 ectodomain of HIV-1, were successfully amplified and sequenced by next generation sequencing (NGS) using the Illumina MiSeq platform. The ability of the four sequence-based diversity measures to correctly identify recent HIV infections was evaluated using the frequency distribution curves, median and interquartile range and area under the curve (AUC) of the receiver operating characteristic (ROC). Comparing the median and interquartile range and evaluating the frequency distribution curves associated with the 4 sequence-based diversity measures, we observed that the percent diversity, number of haplotypes and Shannon entropy demonstrated significant potential to discriminate recent from chronic infections (p<0.0001). Using the AUC of ROC analysis, only the Shannon entropy measure within three HIV-1 env segments could accurately identify recent infections at a satisfactory level. The env segments were gp120 C2_1 (AUC = 0.806), gp120 C2_3 (AUC = 0.805) and gp120 V3 (AUC = 0.812). Our results clearly indicate that the Shannon entropy measure represents a useful tool for predicting HIV-1 infection recency

HIV-1 envelope glycoprotein amino acids signatures associated with clade B transmitted/founder and recent viruses

Background: HIV-1 transmitted/founder viruses (TF) are selected during the acute phase of infection from a multitude of virions present during transmission. They possess the capacity to establish infection and viral dissemination in a new host. Deciphering the discrete genetic determinant of infectivity in their envelope may provide clues for vaccine design. Methods: One hundred twenty-six clade B HIV-1 consensus envelope sequences from untreated acute and early infected individuals were compared to 105 sequences obtained from chronically infected individuals using next generation sequencing and molecular analyses. Results: We identified an envelope amino acid signature associated with TF viruses. They are more likely to have an isoleucine (I) in position 841 instead of an arginine (R). This mutation of R to I (R841I) in the gp41 cytoplasmic tail (gp41CT), specifically in lentivirus lytic peptides segment 1 (LLP-1), is significantly enriched compared to chronic viruses (OR = 0.2, 95% CI (0.09, 0.44), p = 0.00001). Conversely, a mutation of lysine (K) to isoleucine (I) located in position six (K6I) of the envelope signal peptide was selected by chronic viruses and compared to TF (OR = 3.26, 95% CI (1.76–6.02), p = 0.0001). Conclusions: The highly conserved gp41 CT_ LLP-1 domain plays a major role in virus replication in mediating intracellular traffic and Env incorporation into virions in interacting with encoded matrix protein. The presence of an isoleucine in gp41 in the TF viruses’ envelope may sustain its role in the successful establishment of infection during the acute stage

Frequency polygons (ggplot2) of Shannon entropy index of <i>env</i> sequences of recent HIV-1 infected individuals compare to chronically infected ones by <i>env</i> segments.

<p>The Y axis represents the density of observations (frequency) and the X axis the Shannon entropy index distribution as sequence-based diversity measure. The blue color represents plot and distribution for recent HIV-1 infected population and the red color plot and distribution for chronic infected ones.</p

Frequency polygons (ggplot2) of number of haplotypes of <i>env</i> sequences of recent HIV-1 infected individuals compare to chronically infected ones by <i>env</i> segments.

<p>The Y axis represents the density of observations (frequency) and the X axis the number of Haplotypes distribution as sequence-based diversity measure. The blue color represents plot and distribution for recent HIV-1 infected population and the red color plot and distribution for chronic infected ones.</p

Schematic figure showing all <i>env</i> segments used for diversity estimates.

<p>Segments length corresponds to that of strain HXB2 of HIV-1 nucleotides positions. Segments used are denoted by asterisks. Env domain abbreviations: SP, signal peptide; C1–C5, conserved domains 1 to 5; V1–V5, variable domains 1 to 5; FP, fusion peptide; HR1, heptad repeat 1 (NHR); DL, disulfide loop; HR2, heptad repeat 2 (CHR); MPER, membrane proximal ectodomain region; TM, transmembrane domain; CD, cytoplasmic domain. Image were friendly adapted from Michael Caffrey[<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0189999#pone.0189999.ref061" target="_blank">61</a>]; Trends in Microbiology, Volume 19, Issue 4, Pages 191–197 (April 2011) 10.1016/j.tim.2011.02.001.</p

Number of sequences (one per patient) used in this study.

<p>N = 249 derived from 134 recently versus 115 chronically HIV-1 infected individual’s sequences data were included in the study.</p