Transcriptional regulation of alternative Splicing

En el presente trabajo de tesis investigamos aspectos relacionados con el acoplamiento entre la transcripción y el splicing alternativo. Utilizando como modelo al exón alternativo EDI de la fibronectina humana, encontramos que la elongación transcripcional es un importante modulador del splicing alternativo. El Ag T de SV40 activa la replicación del DNA 2 veces, la transcripción entre 12 y 20 veces, y es capaz de provocar un incremento de 25 veces en la inclusión del exón EDI. El efecto del Ag T es específico de exón, ocurre en cis y depende de la replicación del DNA y no de la transformación celular. VP16, un activador de la iniciación y elongación transcripcionales tiene un efecto similar en la transcripción pero opuesto sobre el splicing: inhibe la inclusión de EDI 35 veces. Es más, esta proteína viral es capaz de revertir el efecto del Ag T sobre el splicing de EDI. Consistentemente se determinó que la replicación es capaz de modificar la estructura cromatínica del molde y de ese modo alterar la capacidad elongadora de la RNA pol II. Por otro lado, el enhancer transcripcional del SV4O (una secuencia capaz de aumentar la capacidad elongadora de la RNA pol II) favorece la exclusión del exón EDI en forma independiente de los niveles de RNA. De este modo, la modulación de la capacidad elongadora de la RNA pol II aparece como una nueva forma de regular el splicing alternativo. Independientemente se determinaron dos hechos de importancia: ni el sitio intranuclear de transcripción, ni el reclutamiento de proteínas de splicing por la maquinaria transcripcional parecen tener una influencia importante sobre la decisión de inclusión del exón EDI en el transcripto maduro

Proteína glucosilada obtenida a partir de trigos de interes agronómico y económico : ¿participa en la iniciación de la biosíntesis del almidón?

El almidón es el polisacárido de reserva más abundante presente en los vegetales. Su síntesis se inicia (al igual que su análogo animal, el glucógeno) sobre una proteína que se autoglucosila, y que luego funciona como “primer” sobre el que se sintetiza el polisacárido.Esta proteina fue hallada en maíz y papa. El trabajo de esta Tesis de Licenciatura consistió en la búsqueda de esta actividad en trigo. En este Trabajo de Investigación se logró purificar una actividad de glucosil transferasa. Sus características cinéticas hacen pensar que, al igual que en maíz, hay presentes dos actividades. Se determinó también que el MnH y el CHAPS aumentan la actividad, aunque, al igual que en la proteina aislada en maíz por Curá en 1994 su requerimiento no es absoluto. En las condiciones de este trabajo se sintetiza un oligosacárido cuyas características harían pensar en la posibilidad de que esté involucrado en la biosíntesis del almidón.Fil: Kadener, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Antagonistic effects of T-Ag and VP16 reveal a role for RNA pol II elongation on alternative splicing

Here we investigate the promoter control of alternative splicing by studying two transcriptional activators on templates under replicating conditions. SV40 large T-antigen (T-Ag) activates template replication only 2-fold but transcription 25-fold. T-Ag-mediated replication, reported to inhibit RNA polymerase II elongation, provokes a 10- to 30-fold increase in the inclusion of the fibronectin EDI exon into mature mRNA. The T-Ag effect is exon specific, occurs in cis and depends strictly on DNA replication and not on cell transformation. VP16, an activator of transcriptional initiation and elongation, has a similar effect on transcription but the opposite effect on splicing: EDI inclusion is inhibited by 35-fold. VP16 completely reverts the T-Ag effect, but a VP16 mutant with reduced elongation ability provokes only partial reversion. Both T-Ag and VP16 promote conspicuous co-localization of mRNA with nuclear speckles that contain the SR protein SF2/ASF, a positive regulator of EDI inclusion. Therefore, we conclude that co-localization of transcripts and speckles is not sufficient to stimulate EDI inclusion