OPTIMIZACIÓN DE LA CAPTURA DE AGUA Y LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN LEGUMINOSAS: CONTROL DE LA ARQUITECTURA DE RAÍZ POR FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE RESPUESTA A AUXINAS

Uno de los objetivos principales de la biotecnología moderna es lograr el incremento del rendimiento de los cultivos de relevancia agronómica y al mismo tiempo reducir el impacto ambiental negativo que surge como consecuencia de la actividad humana. La disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo, principalmente nitrógeno, son los factores que mayor impacto tienen sobre el crecimiento de las plantas. Cambios en la disponibilidad de agua y nutrientes afectan la arquitectura de la raíz y el crecimiento de la planta. Las plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces: las raíces laterales (LRs), las cuales participan tanto en la captura de agua como de nutrientes, y los nódulos radicales, los cuales se forman como resultado de la asociación simbiótica con bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium. En el interior de los nódulos, las bacterias se alojan llevando a cabo la fijación biológica de nitrógeno (FBN) que permite la incorporación de nitrógeno al suelo para su explotación en sistemas agropecuarios a muy bajo costo. En los últimos años se ha avanzado en la identificación de genes de la planta que participan de la vía de señalización de la nodulación (Oldroyd, 2013); sin embargo, se desconocen muchos aspectos de los mecanismos moleculares que regulan este proceso que coordina la infección de la bacteria, el desarrollo de un nuevo órgano en la raíz de la leguminosa y las señales del ambiente. Este conocimiento es esencial para establecer criterios que permitan optimizar el proceso de FBN. Los factores de respuesta a auxinas (ARF) 2, 3 y 4 son factores de transcripción regulados a nivel post-transcripcional por la acción de pequeños RNAs. En particular, la vía del microRNA390 (miR390) y el transcripto trans-acting RNA3 (TAS3) resulta en la formación de pequeños RNAs que actúan en trans (tasiRNAs), los cuales regulan negativamente a los factores de transcripción (FTs) de respuesta a auxinas ARF2, ARF3 y ARF4 (Axtell et al., 2006; Montgomery et al., 2008; Xia et al., 2017). Estudios previos demostraron que la vía regula positivamente el crecimiento de las raíces laterales y negativamente la nodulación en plantas de M.truncatula (Hobecker et al., 2017). Las auxinas participan en la formación y crecimiento de las raíces laterales (Marin et al., 2010) como en la infección rizobiana y organogénesis del nódulo. En base a ello nuestra hipótesis de trabajo es que los FTs ARF2, ARF3 y ARF4 contribuirían a regular la sensibilidad y/o la respuesta a auxinas que controla el crecimiento de las raíces laterales y la formación de nódulos fijadores de nitrógeno en plantas leguminosas. En el presente plan de investigación nos proponemos dilucidar la función de los FTs de ARF2, ARF3 y ARF4 en el desarrollo de raíces laterales y nódulos fijadores de nitrógeno en plantas leguminosas con el objetivo a largo plazo de optimizar la captura de agua y la fijación biológica de nitrógeno en sistemas agrícolas

Auxin Response Factor 2 (ARF2), ARF3, and ARF4 Mediate Both Lateral Root and Nitrogen Fixing Nodule Development in Medicago truncatula

Auxin Response Factors (ARFs) constitute a large family of transcription factors that mediate auxin-regulated developmental programs in plants. ARF2, ARF3, and ARF4 are post-transcriptionally regulated by the microRNA390 (miR390)/trans-acting small interference RNA 3 (TAS3) module through the action of TAS3-derived trans-acting small interfering RNAs (ta-siRNA). We have previously reported that constitutive activation of the miR390/TAS3 pathway promotes elongation of lateral roots but impairs nodule organogenesis and infection by rhizobia during the nitrogen-fixing symbiosis established between Medicago truncatula and its partner Sinorhizobium meliloti. However, the involvement of the targets of the miR390/TAS3 pathway, i.e., MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, in root development and establishment of the nitrogen-fixing symbiosis remained unexplored. Here, promoter:reporter fusions showed that expression of both MtARF3 and MtARF4a was associated with lateral root development; however, only the MtARF4a promoter was active in developing nodules. In addition, up-regulation of MtARF2, MtARF3, and MtARF4a/b in response to rhizobia depends on Nod Factor perception. We provide evidence that simultaneous knockdown of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b or mutation in MtARF4a impaired nodule formation, and reduced initiation and progression of infection events. Silencing of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b altered mRNA levels of the early nodulation gene nodulation signaling pathway 2 (MtNSP2). In addition, roots with reduced levels of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, as well as arf4a mutant plants exhibited altered root architecture, causing a reduction in primary and lateral root length, but increasing lateral root density. Taken together, our results suggest that these ARF members are common key players of the morphogenetic programs that control root development and the formation of nitrogen-fixing nodules.Fil: Kirolinko, Cristina Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Hobecker, Karen Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Wen, Jiangqi. Noble Research Institute LLC; Estados UnidosFil: Mysore, Kirankumar S.. Noble Research Institute LLC; Estados UnidosFil: Niebel, Andreas. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Instituto National de Recherches Agronomiques; Francia. Université de Toulouse; FranciaFil: Blanco, Flavio Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Zanetti, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; Argentin

Optimization of water capture and biological nitrogen fixation in legumes: control of root architecture by transcription factors responding to auxins

Uno de los objetivos principales de la biotecnología moderna es lograr el incremento del rendimiento de los cultivos de relevancia agronómica y al mismo tiempo reducir el impacto ambiental negativo que surge como consecuencia de la actividad humana. La disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo, principalmente nitrógeno, son los factores que mayor impacto tienen sobre el crecimiento de las plantas. Cambios en la disponibilidad de agua y nutrientes afectan la arquitectura de la raíz y el crecimiento de la planta. La plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces: las raíces laterales (LRs), las cuales participan tanto en la captura de agua como de nutrientes, y los nódulos radicales, los cuales se forman como resultado de la asociación simbiótica con bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium. En el interior de los nódulos, las bacterias se alojan llevando a cabo la fijación biológica de nitrógeno (FBN) que permite la incorporación de nitrógeno al suelo para su explotación en sistemas agropecuarios a muy bajo costo. En los últimos años se ha avanzado en la identificación de genes de la planta que participan de la vía de señalización de la nodulación (Oldroyd, 2013); sin embargo se desconocen muchos aspectos de los mecanismos moleculares que regulan este proceso que coordina la infección de la bacteria, el desarrollo de un nuevo órgano en la raíz de la leguminosa y las señales del ambiente. Este conocimiento es esencial para establecer criterios que permitan optimizar el proceso de FBN. Los factores de respuesta a auxinas (ARF) 2, 3 y 4 son factores de transcripción regulados a nivel post-transcripcional por la acción de pequeños RNAs. En particular, la vía del microRNA390 (miR390) y el transcripto trans-acting RNA3 (TAS3) resulta en la formación de pequeños RNAs que actúan en trans (tasiRNAs), los cuales regulan negativamente a los factores de transcripción (FTs) de respuesta a auxinas ARF2, ARF3 y ARF4 (Axtell et al., 2006; Montgomery et al., 2008; Xia et al., 2017). Estudios previos demostraron que la vía regula positivamente el crecimiento de las raíces laterales y negativamente la nodulación en plantas de M.truncatula (Hobecker et al., 2017). Las auxinas participan en la formación y crecimiento de las raíces laterales (Marin et al., 2010) como en la infección rizobiana y organogénesis del nódulo. En base a ello nuestra hipótesis de trabajo es que los FTs ARF2, ARF3 y ARF4 contribuirían a regular la sensibilidad y/o la respuesta a auxinas que controla el crecimiento de las raíces laterales y la formación de nódulos fijadores de nitrógeno en plantas leguminosas. En el presente plan de investigación nos proponemos dilucidar la función de los FTs de ARF2, ARF3 y ARF4 en el desarrollo de raíces laterales y nódulos fijadores de nitrógeno en plantas leguminosas con el objetivo a largo plazo de optimizar la captura de agua y la fijación biológica de nitrógeno en sistemas agrícolas.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula

Caracterización funcional de factores de transcripción asociados a la respuesta a auxinas en raíces de M. truncatula

Las plantas leguminosas tienen la capacidad de formar dos tipos de órganos postembrionarios en sus raíces; por un lado, las raíces laterales (RLs) que participan en la captura de agua y nutrientes, y por otro, los nódulos fijadores de nitrógeno que surgen como resultado de la asociación simbiótica con bacterias del suelo llamadas rizobios. Esta interacción simbiótica permite la asimilación de nitrógeno atmosférico al metabolismo de la planta. La formación de nódulos fijadores de nitrógeno depende de un intercambio de señales entre ambos simbiontes, en el cual una molécula de naturaleza lipo-quitooligosacárida secretada por los rizobios, denominada factor Nod, es responsable de la activación de dos programas morfogenéticos en la raíz de la planta: la organogénesis del nódulo y la infección microbiana. Ambos tipos de órganos influencian directamente el crecimiento y desarrollo de la planta, por lo que comprender los mecanismos del desarrollo de raíces laterales y nódulos es crucial para mejorar la productividad de los cultivos de plantas leguminosas en sistemas agrícolas. Las auxinas son hormonas vegetales con funciones cruciales en el desarrollo y la vida de las plantas. Diversos trabajos han demostrado que las raíces laterales y los nódulos comparten programas de desarrollo superpuestos que convergen en la formación e interpretación de los niveles máximos de auxina (auxina máxima). La percepción e interpretación de esta auxina máxima involucra una cascada de señalización que culmina en la activación de factores de transcripción de respuesta a auxinas (ARFs por Auxin Response Factors). Los ARFs constituyen una gran familia de factores que median diferentes programas de desarrollo regulados por auxinas en las plantas. En particular, los ARF2, ARF3 y ARF4 son regulados postranscripcionalmente por una vía que involucra al microRNA390 (miR390) y al transcripto no codificante TAS3 (Trans-Acting siRNA 3). El clivaje de TAS3 guiado por el miR390 da lugar a la producción de pequeños RNAs de interferencia que actúan en trans (tasiRNAs por transacting interference small RNA) produciendo el clivaje de los transcriptos ARF2, ARF3 y ARF4. Anteriormente, en nuestro laboratorio se demostró que la activación constitutiva de la vía miR390/TAS3 promueve el alargamiento de las raíces laterales, pero afecta negativamente la organogénesis de los nódulos y la infección por rizobios durante la simbiosis fijadora de nitrógeno establecida entre la leguminosa Medicago truncatula y su par simbiótico Sinorhizobium meliloti. En este trabajo de tesis doctoral, observamos que la regulación de MtARF2, MtARF3 y MtARF4a/b en respuesta a los rizobios depende de la percepción del factor Nod. A su vez, proporcionamos evidencia de que el silenciamiento simultáneo de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b o una mutación en el gen MtARF4a restringen la formación de nódulos y reducen el inicio y la progresión de los eventos de infección. Evidenciamos también que el silenciamiento de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b altera los niveles del RNA mensajero (mRNA) que codifica el factor de transcripción de tipo GRAS NSP2 (Nodulation Signaling 2), el cual es un componente de la vía de señalización temprana de la nodulación. Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) indicaron que MtNSP2 sería un target directo de MtARF2, sustentando la hipótesis que la vía miR390/TAS3/ARFs se interconecta directamente con la ruta de señalización del factor Nod. Además, las raíces con niveles reducidos de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b, así como las plantas mutantes arf4a, exhiben una arquitectura de raíz alterada, evidenciada en una reducción en la longitud de las raíces (principal y lateral) y un aumento en la densidad de las raíces laterales. A partir de un análisis transcriptómico se identificó que el gen MtLBD17/29a -un miembro de la familia LBD (Lateral Organ Boundaries Domain)- aumenta su expresión en respuesta al rizobio en raíces control, pero no en raíces que poseen activada la vía miR390/TAS3. Tampoco se verificó un aumento de los niveles del transcripto MtLBD17/29a en respuesta al rizobio en raíces silenciadas en MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b o en mutantes en MtARF4a. Más aun, ensayos de ChIP-PCR indicaron que MtARF2 se une directamente a una región promotora del gen MtLBD17/29a, sugiriendo que MtLBD17/29a sería un target directo de MtARF2. Los estudios de expresión espacio temporal mediante fusiones del promotor de MtLBD17/29a a genes reporteros revelaron que el promotor es activo en la zona meristemática de las raíces principales y laterales y en los primordios de las raíces laterales. Además, se observó actividad del promotor MtLBD17/29a en las células de la raíz subyacentes al sitio de infección del rizobio en etapas tempranas de la interacción simbiótica, y en las células del nódulo que rodean a las células infectadas en etapas más tardías de la simbiosis. Dicha expresión se solapa con la expresión de genes que son miembros de la vía miR390/TAS3 y del gen MtARF4a. De manera similar a lo descripto para MtARF2, MtARF3 y MtARF4a/b, la regulación de MtLBD17/29a en respuesta a los rizobios es dependiente de la percepción del factor Nod y requiere del regulador transcripcional maestro de la nodulación NIN (Nodule INception). Tanto el silenciamiento como la sobrexpresión de MtLBD17/29a afectaron la formación de nódulos y redujeron el número de los eventos de infección, sugiriendo que se requiere una fina regulación de los niveles de MtLBD17/29a para el establecimiento exitoso de la simbiosis fijadora de nitrógeno. Observamos también que el silenciamiento de MtLBD17/29a altera los niveles de RNA mensajero del gen MtNSP2. Por otra parte, las plantas que sobreexpresan MtLBD17/29a o silenciadas en dicho gen exhibieron una arquitectura de raíz alterada: mientras que las plantas silenciadas mostraron una reducción en la longitud de las raíces (principal y lateral) y un incremento en la densidad de las raíces laterales, las plantas que sobrexpresan MtLBD17/29a exhibieron un fenotipo opuesto, un aumento en la longitud de las raíces y una disminución en la densidad de las raíces laterales. En conjunto, nuestros resultados sugieren que estos miembros de la familia ARF y LBD son factores de transcripción que actúan de manera jerárquica modulando los programas morfogenéticos de desarrollo de las raíces y la formación de nódulos fijadores de nitrógeno.Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias BiológicasUniversidad Nacional de La PlataFacultad de Ciencias Exacta

Auxin Response Factor 2 (ARF2), ARF3, and ARF4 Mediate Both Lateral Root and Nitrogen Fixing Nodule Development in <i>Medicago truncatula</i>

Auxin Response Factors (ARFs) constitute a large family of transcription factors that mediate auxin-regulated developmental programs in plants. ARF2, ARF3, and ARF4 are post-transcriptionally regulated by the microRNA390 (miR390)/trans-acting small interference RNA 3 (TAS3) module through the action of TAS3-derived trans - acting small interfering RNAs (ta-siRNA). We have previously reported that constitutive activation of the miR390/TAS3 pathway promotes elongation of lateral roots but impairs nodule organogenesis and infection by rhizobia during the nitrogen-fixing symbiosis established between Medicago truncatula and its partner Sinorhizobium meliloti. However, the involvement of the targets of the miR390/TAS3 pathway, i.e., MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, in root development and establishment of the nitrogen-fixing symbiosis remained unexplored. Here, promoter:reporter fusions showed that expression of both MtARF3 and MtARF4a was associated with lateral root development; however, only the MtARF4a promoter was active in developing nodules. In addition, up-regulation of MtARF2, MtARF3, and MtARF4a/b in response to rhizobia depends on Nod Factor perception. We provide evidence that simultaneous knockdown of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b or mutation in MtARF4a impaired nodule formation, and reduced initiation and progression of infection events. Silencing of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b altered mRNA levels of the early nodulation gene nodulation signaling pathway 2 (MtNSP2). In addition, roots with reduced levels of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, as well as arf4a mutant plants exhibited altered root architecture, causing a reduction in primary and lateral root length, but increasing lateral root density. Taken together, our results suggest that these ARF members are common key players of the morphogenetic programs that control root development and the formation of nitrogen-fixing nodules.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula

Identification of conserved and new miRNAs that affect nodulation and strain selectivity in the Phaseolus vulgaris–Rhizobium etli symbiosis through differential analysis of host small RNAs

Phaseolus vulgaris plants from the Mesoamerican centre of genetic diversification establish a preferential and more efficient root nodule symbiosis with sympatric Rhizobium etli strains. This is mediated by changes in host gene expression, which might occur either at the transcriptional or at the post-transcriptional level. However, the implication of small RNA (sRNA)-mediated control of gene expression in strain selectivity has remained elusive. sRNA sequencing was used to identify host microRNAs (miRNAs) differentially regulated in roots at an early stage of the symbiotic interaction, which were further characterized by applying a reverse genetic approach. In silico analysis identified known and new miRNAs that accumulated to a greater extent in the preferential and more efficient interaction. One of them, designated as Pvu-miR5924, participates in the mechanisms that determine the selection of R. etli strains that will colonize the nodules. In addition, the functional analysis of Pvu-miR390b verified that this miRNA is a negative modulator of nodule formation and bacterial infection. This study not only extended the list of miRNAs identified in P. vulgaris but also enabled the identification of miRNAs that play relevant functions in nodule formation, rhizobial infection and the selection of the rhizobial strains that will occupy the nodule.Fil: Castaingts, Mélisse. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Kirolinko, Cristina Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Rivero Hernandez, Claudio Hernan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Artunian, Jennifer. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Mancini Villagra, Ulises Maximiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Blanco, Flavio Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Zanetti, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; Argentin