MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTICS OF PRIMARY TUMOR AND METASTATIC LYMPHATIC NODES IN BREAST CANCER

The purpose of systemic treatment in patients with breast cancer is based largely on the molecular characteristics of the primary tumor, but many clinical recommendations suggest also the study of metastatic nodes with an assessment of their receptor status (estrogen receptor ER, progesterone receptor RP, human epidermal growth factor receptor 2 Her2/neu). This is due to the fact that according to numerous studies, the discrepancy between the status of the primary tumor and the secondary nodes can reach high rates: 3–54 % for ER, 5–78 % for RP, and 0–34 % for Her2/neu. At the same time, more and more data actively demonstrate the imperfection of immunohistochemical analysis and the need to study additional parameters to improve the quality of diagnosis of patients with breast cancer. Material and methods. A morphological and immunohistochemical study of the tumor tissue of the primary node and axillary lymph nodes was performed in 199 patients with breast cancer (T1-3N0-3M0) using standard methods, and RT-PCR was also studied with the expression of 24 genes. Results. The incidence of differences between the molecular phenotypes of the main tumor and metastatic axillary lymph nodes was 26 (26 %) of 99 cases. Most often, differences were noted in cases of breast cancer with luminal A type – 13 cases (50 %). According to the results of a comparative PCR analysis of tissue samples from the primary tumor and metastatic regional lymph nodes, only the expression of the CD68, ERSR1, GRB7 and MMD11 receptors was statistically significant. Conclusion. The results indicate the need for an integrated approach and additional methods for the diagnosis of breast cancer, which will undoubtedly improve the quality of planning and the effectiveness of systemic treatment in patients with breast cancer

Исследование влияния генетического варианта c.470T>C в гене CHEK2 на повышение риска развития рака молочной железы у населения Российской Федерации

Introduction. Currently, there are conflicting data regarding the effect of the c.470T> C germline mutation in the CHEK2 gene on increasing the risk of breast cancer (BC), so it is necessary to conduct research on large samples of patients, including in the Russian population, in order to analyze the contribution of this mutation to the risk of cancer developing.The aim of the study was to determine the frequency of occurrence of the genetic variant c.470Т>С in the CHEK2 gene in the Russian population in patients with BC and patients with benign breast diseases (BBD) to assess the possible effect of this deoxyribonucleic acid damage on the likelihood of cancer occurrence.Materials and methods. The study included 2,787 patients with BC and 1,004 patients with BBD who underwent examination and treatment at the Russian Scientific Center of Roentgenoradiology of the Ministry of the Russian Federation from 2010 to 2018. Molecular genetic study was carried out by real-time polymerase chain reaction to determine the characteristic of the Russian population hereditary genetic variant c.470Т>С in the CHEK2 gene using a diagnostic panel that allows to determine three germline mutations: c.1100delC, c.444+1G>A and c.470Т>С in the CHEK2 gene.Results. In patients with BC the frequency of the mutation c.470T>C in the CHEK2 gene was 3.8 %, in patients with BBD this mutation was detected in 4.7 % of cases. The frequency of the genetic variant c.470T>C in high-risk groups was: 5.1 % – for BC patients with clinical signs of hereditary disease and 4.9 % – for patients with BBD with a family history of cancer. There were no statistically significant differences between the frequency of the mutation c.470T>C in the general groups of BC patients and patients with BBD and the corresponding frequency in the high-risk groups, as well as in the groups of BC patients and patients with BBD (p >0.05).Conclusion. The results of this study indicate the probable absence of a relationship between the presence of the mutation c.470Т>С in the CHEK2 gene and an increased risk of BC.Введение. В настоящее время имеются противоречивые данные относительно влияния герминальной мутации с.470Т>С в гене CHEK2 на повышение риска возникновения рака молочной железы (РМЖ), поэтому необходимы исследования на больших выборках больных, в том числе в российской популяции, в целях анализа вклада данной мутации в риск развития онкологического заболевания.Цель исследования – определение частоты встречаемости генетического варианта с.470Т>С в гене CHEK2 в российской популяции у больных РМЖ и пациенток с доброкачественными заболеваниями молочной железы (ДЗМЖ) для  оценки возможного влияния данного повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты на вероятность возникновения онкологического заболевания. Материалы и методы. В исследование были включены 2787 больных РМЖ и 1004 пациентки с ДЗМЖ, проходившие обследование и лечение в ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России с 2010 по 2018 г. Молекулярно-генетическое исследование для определения характерного для российской популяции наследственного генетического варианта с.470Т>С в гене CHEK2 было проведено методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием диагностической панели, позволяющей определять три герминальные мутации: с.1100delC, c.444+1G>A и с.470Т>С в гене CHEK2.Результаты. У больных с диагнозом РМЖ частота мутации c.470T>C в гене CHEK2 составила 3,8 %, у пациенток с ДЗМЖ данная мутация выявлена в 4,7 % случаев. Частота генетического варианта c.470T>C в группах повышенного риска составила 5,1 % для больных РМЖ с клиническими признаками наследственного заболевания и 4,9 % для  пациенток с  ДЗМЖ, имеющих онкологически отягощенный семейный анамнез. Статистически значимых различий между частотой мутации c.470T>C в общих группах больных РМЖ и пациенток с ДЗМЖ и  соответствующей частотой в  группах повышенного риска, а  также в  группах больных РМЖ и  пациенток с ДЗМЖ не установлено (p >0,05).Заключение. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о вероятном отсутствии связи между наличием мутации с.470Т>С в гене CHEK2 и повышением риска развития РМЖ

Исследование цитостатических и цитотоксических свойств модифицированных пептидных ингибиторов CDK4/6, функциональных аналогов p16INK4a (90-97)

Background. Application of mathematical modeling for search for biologically active molecules is currently a promising scientific approach. Application of numerical algorithms for optimization of peptide sequences and molecular dynamics allowed to obtain modified peptide sequences that are functional analogs of the sequence of natural inhibitor of cyclin-dependent kinase 4/6 p16INK4a.The study objective is to establish biological characteristics of peptide sequences of CDK 4/6 inhibitors obtained using mathematical modeling.Materials and methods. The studies were performed in vitro using tumor cell lines (MCF-7, А549, SKOV-3, НСТ116). Apoptosis level, cell distribution per cell cycle stages, changes in Bcl-2 expression, changes in the level of phosphorylated pRb under the effect of the studied molecules were investigated using flow cytometry. Proliferation dynamics of cell populations were studied using RTCA iCELLIgence biosensor technology.Results. Peptide sequences obtained using mathematical modeling decrease the level of phosphorylated pRb, Bcl-2 expression when applied to actively proliferating cells. These proteins serve as molecular targets for the cyclin-dependent kinase 4/6–cyclin D complex, and changes in pRb and Bcl-2 levels might indicate inhibition of complex formation. Consequently, decreased proliferative activity and increased apoptosis were observed. Effectiveness of the peptide sequences depended on their molecular structure and type of the used cell line. Two (2) of the studied modified peptide sequences have higher antiproliferative and proapoptotic effect on tumor cells than native p16INK4a (90-97) sequence.Conclusion. Application of mathematical modeling for search and development of functionally active molecules allowed to create peptide sequences with stronger cyclin-dependent kinase inhibitor effect than p16INK4a, the native inhibitor CDK4/6.Введение. Использование методов математического моделирования для поиска биологически активных молекул – перспективное направление современной науки. Применение численных алгоритмов для оптимизации пептидных последовательностей и методов молекулярной динамики позволило получить модифицированные пептидные последовательности, являющиеся функциональными аналогами последовательности естественного ингибитора циклиновой киназы 4/6 – p16INK4a.Цель исследования – определение биологических свойств пептидных последовательностей, ингибиторов CDK4/6, полученных с помощью методов математического моделирования.Материалы и методы. Исследования проведены в условиях in vitro на линиях опухолевых клеток (MCF-7, А549, SKOV-3, НСТ116). Методом проточной цитофлуориметрии были определены уровень апоптоза, распределение клеток по фазам клеточного цикла, изменение экспрессии белка Bcl-2, изменение уровня фосфорилированного pRb при воздействии на клетки исследуемых пептидных последовательностей. С помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence проведена оценка динамики пролиферации клеточных популяций.Результаты. Пептидные последовательности, полученные с помощью методов математического моделирования, при воздействии на активно пролиферирующие клетки вызывают снижение уровня фосфорилированного pRb, снижение экспрессии Bcl-2, которые являются молекулярными «мишенями» комплекса циклинзависимая киназа 4/6–циклин D, и изменение уровней pRb и Bcl-2 может свидетельствовать об ингибировании образования комплекса. Как следствие, наблюдались снижение пролиферативной активности и увеличение уровня апоптоза в клетках. Эффективность пептидных последовательностей зависела от молекулярной структуры, типа клеточной линии, на которую происходит воздействие. Показано, что 2 исследованные модифицированные пептидные последовательности оказывают на опухолевые клетки антипролиферативный и проапоптотический эффекты в большей степени, чем исходная последовательность p16INK4a (90-97).Заключение. Использование методов математического моделирования для поиска и разработки функционально активных молекул позволило создать пептидные последовательности, обладающие более выраженными свойствами ингибиторов циклиновых киназ, чем естественный ингибитор CDK4/6 – p16INK4a

ВЭЖХ определение, фармакокинетика и относительная биодоступность левофлоксацина производства ООО «ОЗОН», Россия

A simple, specific, sensitive and reproducible good method for quantitative determination of Levofloxacin in plasma using HPLC with UV-spectrophotometric detection. With this technique the pharmacokinetics and relative bioavailability of domestic generic of levofloxacin in 18 healthy volunteers after a single oral dose of 500 mg. Found that the drug being tested, levofloxacin (OOO «Ozone», Russia) is bioequivalent to the reference drugs Tavanic® («Sanofi Winthrop Industry», France).Описана простая, специфичная, чувствительная и хорошо воспроизводимая методика количественного определения левофлоксацина в плазме крови с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ- спектрофотометрическим детектированием. С помощью настоящей методики изучена фармакокинетика и относительная биодоступность отечественного воспроизведённого препарата левофлоксацин у 18 здоровых добровольцев после однократного перорального приёма в дозе 500 мг. Установлено, что тестируемый препарат левофлоксацин (ООО «Озон», Россия) является биоэквивалентным препарату сравнения Таваник® («Санофи Винтроп Индустрия», Франция)

ВОЗМОЖНОСТИ ТИПИРОВАНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДИКИ ОТ-ПЦР

 Introduction. Adjuvant systemic therapy remains one of the main options for treating breast cancer. Results of standard immunohistochemical studies are not always a criterion for selecting systemic therapy. Nowadays, multigene expression analysis is actively used to predict the response to chemotherapy in patients with earlystage breast cancer. We studied a 24-gene multi-gene panel for typing breast cancer.Material and Methods. A prospective analysis of 199 breast cancer patients (T1–3N0–3M0) was carried out. Surgical specimens were studied using the standard immunohistochemistry (IHC) and RT-PCR for detecting expression of 24 genes.Results. According to the IHC results, breast cancer was divided into 5 molecular subtypes: luminal A was detected in 59 (30 %) patients; luminal B (HER2-negative) in 52 (26 %); luminal B (HER2-positive) in 19 (9 %); triple-negative in 28 (14 %); HER2-positive 41 (21 %). RT-PCR showed that ST K15, MYC, MYBL2, BIRCC 5, BCL2, TERT, ESRP1, PGR, HER2, GBR7, MGB1 and MMP11 were the most significant genes in subtype distribution. The total percentage of matches between the two studies was 61.7 %.Conclusion. Studies have shown the need to add additional typing methods for breast cancer to a standard IHC study, which will undoubtedly increase the information content of diagnostic measures and will improve the effectiveness of the treatment.Введение. Адъювантная системная терапия остается одним из основных методов лечения у больных раком молочной железы. Результаты стандартного иммуногистохимического исследования не всегда в полной мере являются критерием для выбора системной терапии. Для прогнозирования эффективности лечения при ранних стадиях активно применяется мультигенный экспрессионный анализ. Была изучена отечественная мультигенная панель, состоящая из 24 генов, позволяющая типировать рак молочной железы.Материал и методы. Проводился проспективный анализ 199 больных РМЖ (T1–3N0–3M0), в ходе которого операционный материал подвергался стандартному иммуногистохимическому исследованию, а также он изучался методом ОТ-ПЦР с выявлением экспрессии 24 генов.Результаты. По результатам ИГХ осуществлялось молекулярное типирование РМЖ с выделением 5 подтипов: люминальный тип А был выявлен у 59 (30 %) больных; люминальный В (HER2-негативный) – у 52 (26 %); люминальный В (HER2-позитивный) – у 19 (9 %); трижды негативный – у 28 (14 %); HER2позитивный – у 41 (21 %) пациента. По данным ОТ-ПЦР наиболее значимыми генами в распределении на подтипы рака молочной железы являлись: ST K15, MYC, MYBL2, BIRCC 5, BCL2, TERT, ESRP1, PGR, HER2, GBR7, MGB1 и MMP11. При дальнейшем анализе суммарное число совпадений данных двух исследований составило 61,7 %.Заключение. Проведенные исследования продемонстрировали необходимость добавления дополнительных методов типирования рака молочной железы к стандартному ИГХ-исследованию, что, несомненно, повысит информативность диагностических мероприятий и позволит повысить эффективность проводимого лечения

Исследование подавления роста опухоли, экспрессирующей раково-эмбриональный антиген, новым высокотехнологичным препаратом карплазмин (CAR-T-терапия) у мышей линии Balb/c nude

Introduction. Adoptive immunotherapy based on chimeric antigen receptors (CAR) is considered as a promising direction in the treatment of solid malignant tumors. To produce genetically modified human T-lymphocytes, lenti/retroviral transduction is currently most often used. However, safety concerns associated with the viral vector production and possible unwanted genome modification limit the clinical utility of CAR-T cells. Therefore, non-viral transfection methods, in particular electroporation, using of DNA or RNA vectors, are being actively studied as a method for producing CAR-T lymphocytes.Aim. To evaluate in vivo antitumor activity of the new high-tech drug carplasmin, intended for CAR-T therapy of tumors expressing carcinoembryonic antigen (CEA). Materials and methods. Carplasmin was obtained by electroporation of activated human lymphocytes with plasmid DNA carrying the third generation CAR gene specific to CEA. The study was performed on a human colorectal cancer xenograft model obtained by intraperitoneal injection of CEA-positive HCT116 cell line to athymic Balb/c nude mice. Carplasmin treatment was carried out once a week, starting from the third day after HCT116 cell inoculation. Mice in the two control groups were treated with either electroporated lymphocytes without plasmid addition (pulse-lymphocytes) or RPMI-1640 culture medium (group without treatment).Results. In vivo, carplasmin demonstrated a pronounced antitumor effect. Seven weekly injections of the drug to inoculated mice led to a prominent effect of antitumor therapy: 80 % of the animals in the experimental group survived (with 40 % of the mice had a complete remission without signs of a detectable tumor), compared to 100 % death in the control group (without treatment).Conclusion. The results of preclinical efficacy studies demonstrate that carplasmin is a promising drug for the treatment of CEA-positive intraperitoneal tumors.Введение. Адоптивная иммунотерапия на основе химерных антигенных рецепторов (CAR) рассматривается как перспективное направление в лечении солидных злокачественных опухолей. Для получения генетически модифицированных Т-лимфоцитов человека в настоящее время чаще всего используется ленти-/ретровирусная трансдукция. Однако проблемы безопасности, связанные с продукцией вирусного вектора и возможной нежелательной модификацией генома, ограничивают клиническую применимость CAR-Т-клеток. Поэтому невирусные методы трансфекции, в частности электропорация с использованием ДНК- или РНК-векторов, активно исследуются как подход для получения CAR-T-лимфоцитов.Цель исследования – оценка противоопухолевой активности in vivo нового высокотехнологичного лекарственного средства карплазмин, предназначенного для CAR-T-терапии опухолей, экспрессирующих раково-эмбриональный антиген (РЭА).Материалы и методы. Карплазмин получен методом электропорации активированных лимфоцитов человека плазмидной ДНК, несущей ген CAR 3-го поколения, специфичный к РЭА. Исследование выполнено на модели ксенотрансплантата колоректального рака человека, полученной при интраперитонеальном введении РЭА-положительных клеток линии HCT116 бестимусным мышам линии Balb/c nude. Введение карплазмина проводили 1 раз в неделю, начиная с 3-го дня после прививания клеток HCT116. Мышам 2 контрольных групп вводили либо лимфоциты, подвергнутые электропорации без внесения плазмиды (пульс-лимфоциты), либо культуральную среду RPMI-1640 (группа без лечения).Результаты. In vivo карплазмин демонстрировал выраженное противоопухолевое действие. Семь еженедельных введений препарата привитым мышам привели к выраженному эффекту противоопухолевой терапии: 80 % животных в экспериментальной группе выжили (при этом у 40 % мышей наблюдалась полная ремиссия без признаков определяемой опухоли), тогда как в контрольной (без лечения) группе 100 % животных погибли.Заключение. Результаты доклинических исследований эффективности демонстрируют, что карплазмин является перспективным препаратом для терапии РЭА-позитивных интраперитонеальных опухолей

Исследование уровня экспрессии генов-маркеров пролиферативной активности в слизистой оболочке толстой кишки при различной патологии

Background. The search for molecular markers of colon diseases allowing highly specific and sensitive identification and differentiation of pathological processes is a clinically important problem. Expression levels of genes responsible for proliferation can reflect the changes in the affected tissues. The study objective is to perform comparative analysis of molecular and genetic markers of proliferative activity in benign and malignant neoplasms of the colon. Materials and methods. Analysis of the changes in proliferation markers (CCND1, с-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) in adenocarcinoma of the colon (n = 259), resection margin (about 15–20 cm from the tumor lesion) (n = 251), unchanged colon mucosa from healthy donors (n = 247), polyps (n = 28), unchanged colon mucosa intestinal polyposis (10–15 cm from the polyp) (n = 75) was performed using RT-PCR. Results and conclusion. It was shown that morphologically unchanged tissue of intestinal mucosa in malignant tumors has significant differences from normal tissue of healthy donors. Significant differences in the level of expression of genes responsible for the processes of proliferation, с-MYC, CCND1, TERT were found in benign hyperproliferative diseases (polyps). Moreover, these changes were specific to the type of pathological process, which allows us to consider these genes as the most promising candidates in the development of a differential method for diagnosing colon diseases.Введение. Поиск молекулярных маркеров диагностики заболеваний толстой кишки, способных с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять и дифференцировать патологический процесс, является актуальной клинически важной задачей. Уровень экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации, может отражать картину изменений в тканях пораженного органа. Цель исследования – сравнительный анализ молекулярно-генетических маркеров пролиферативной активности при доброкачественных и злокачественных новообразованиях толстой кишки. Материалы и методы. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени проведен анализ изменений экспрессии маркеров пролиферации (CCND1, с-MYC, Ki-67, HER2neu, TERT) в следующих тканях: аденокарциномы толстой кишки (n = 259), края резекции (около 15–20 см от опухолевого узла) (n = 251), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки здоровых доноров (n = 247), полипов (n = 28), неизмененной слизистой оболочки толстой кишки при полипах (10–15 см от полипа) (n = 75). Результаты и заключение. Установлено, что в тканях полипов толстой кишки наблюдаются достоверные различия в уровне экспрессии генов, ответственных за процессы пролиферации (с-MYC, CCND1, TERT). Выявленные различия специфичны для типа патологического процесса, что позволяет рассматривать данные гены в качестве наиболее перспективных кандидатов при разработке дифференциального метода диагностики заболеваний толстой кишки

Monitoring of breast cancer progression via aptamer-based detection of circulating tumor cells in clinical blood samples

Introduction: Breast cancer (BC) diagnostics lack noninvasive methods and procedures for screening and monitoring disease dynamics. Admitted CellSearch® is used for fluid biopsy and capture of circulating tumor cells of only epithelial origin. Here we describe an RNA aptamer (MDA231) for detecting BC cells in clinical samples, including blood. The MDA231 aptamer was originally selected against triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 using cell-SELEX.Methods: The aptamer structure in solution was predicted using mFold program and molecular dynamic simulations. The affinity and specificity of the evolved aptamers were evaluated by flow cytometry and laser scanning microscopy on clinical tissues from breast cancer patients. CTCs were isolated form the patients’ blood using the developed method of aptamer-based magnetic separation. Breast cancer origin of CTCs was confirmed by cytological, RT-qPCR and Immunocytochemical analyses.Results: MDA231 can specifically recognize breast cancer cells in surgically resected tissues from patients with different molecular subtypes: triple-negative, Luminal A, and Luminal B, but not in benign tumors, lung cancer, glial tumor and healthy epithelial from lungs and breast. This RNA aptamer can identify cancer cells in complex cellular environments, including tumor biopsies (e.g., tumor tissues vs. margins) and clinical blood samples (e.g., circulating tumor cells). Breast cancer origin of the aptamer-based magnetically separated CTCs has been proved by immunocytochemistry and mammaglobin mRNA expression.Discussion: We suggest a simple, minimally-invasive breast cancer diagnostic method based on non-epithelial MDA231 aptamer-specific magnetic isolation of circulating tumor cells. Isolated cells are intact and can be utilized for molecular diagnostics purposes

Gene expression analysis of proliferation and apoptosis depending on the status of steroid hormone receptors in breast cancer

In normal cell apoptosis and proliferation are strictly controlled by intra- and extracell mechanisms. These signals interfere with cell pathways through cell receptors, estrogen, progesterone, HER2/neu receptors in the case of breast cancer. Expression of apoptotic and proliferative genes is different in breast cancer depending on hormonal status. Besides correlation analysis shows different role of cell receptors in proliferation control in normal and breast tissue

Study of cytostatic and cytotoxic characteristics of modified peptide CDK4/6 inhibitors – functional analogs of p16INK4a (90-97)

Background. Application of mathematical modeling for search for biologically active molecules is currently a promising scientific approach. Application of numerical algorithms for optimization of peptide sequences and molecular dynamics allowed to obtain modified peptide sequences that are functional analogs of the sequence of natural inhibitor of cyclin-dependent kinase 4/6 p16INK4a.The study objective is to establish biological characteristics of peptide sequences of CDK 4/6 inhibitors obtained using mathematical modeling.Materials and methods. The studies were performed in vitro using tumor cell lines (MCF-7, А549, SKOV-3, НСТ116). Apoptosis level, cell distribution per cell cycle stages, changes in Bcl-2 expression, changes in the level of phosphorylated pRb under the effect of the studied molecules were investigated using flow cytometry. Proliferation dynamics of cell populations were studied using RTCA iCELLIgence biosensor technology.Results. Peptide sequences obtained using mathematical modeling decrease the level of phosphorylated pRb, Bcl-2 expression when applied to actively proliferating cells. These proteins serve as molecular targets for the cyclin-dependent kinase 4/6–cyclin D complex, and changes in pRb and Bcl-2 levels might indicate inhibition of complex formation. Consequently, decreased proliferative activity and increased apoptosis were observed. Effectiveness of the peptide sequences depended on their molecular structure and type of the used cell line. Two (2) of the studied modified peptide sequences have higher antiproliferative and proapoptotic effect on tumor cells than native p16INK4a (90-97) sequence.Conclusion. Application of mathematical modeling for search and development of functionally active molecules allowed to create peptide sequences with stronger cyclin-dependent kinase inhibitor effect than p16INK4a, the native inhibitor CDK4/6