Characterization of functional subgroups among genetically identified cholinergic neurons in the pedunculopontine nucleus

L

Glycinergic input to the mouse basal forebrain cholinergic neurons

L

Endocannabinoid signaling modulates neurons of the pedunculopontine nucleus (PPN) via astrocytes.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is known as the cholinergic part of the reticular activating system (RAS) and it plays an important role in transitions of slow-wave sleep to REM sleep and wakefulness. Although both exogenous and endocannabinoids affect sleep, the mechanism of endocannabinoid neuromodulation has not been characterized at cellular level in the PPN. In this paper, we demonstrate that both neurons and glial cells from the PPN respond to cannabinoid type 1 (CB1) receptor agonists. The neuronal response can be depolarization or hyperpolarization, while astrocytes exhibit more frequent calcium waves. All these effects are absent in CB1 gene-deficient mice. Blockade of the fast synaptic neurotransmission or neuronal action potential firing does not change the effect on the neuronal membrane potential significantly, while inhibition of astrocytic calcium waves by thapsigargin diminishes the response. Inhibition of group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) abolishes hyperpolarization, whereas blockade of group II mGluRs prevents depolarization. Initially active neurons and glial cells display weaker responses partially due to the increased endocannabinoid tone in their environment. Taken together, we propose that cannabinoid receptor stimulation modulates PPN neuronal activity in the following manner: active neurons may elicit calcium waves in astrocytes via endogenous CB1 receptor agonists. Astrocytes in turn release glutamate that activates different metabotropic glutamate receptors of neurons and modulate PPN neuronal activity

Ioncsatornák, modulációs mechanizmusok és szinaptikus kapcsolatok jelentősége a patkány nucleus cochlearis jelfeldolgozó működésében = Roles of ion channels, modulatory mechanisms and synaptic connections in the signal processing of the rat cochlear nucleus

A projekt célja a nucleus cochlearis jelfeldolgozó tevékenységében jelentős ioncsatornák, modulációs mechanizmusok és szinaptikus kapcsolatok elemzése volt. A munka legfontosabb eredményei a következők: (a) Azonosítottuk a nucleus cochlearisban expresszált HCN-csatornaalegységeket. Feltártuk a h-áram jelentőségét az óriássejtek elektromos sajátságaiban és szinaptikus kapcsolataik finomhangolásában. (b) Leírtuk a kolinerg ingerlés hatását az óriássejtek elektrofiziológiai sajátságaira és a rajtuk kialakuló posztszinaptikus áramokra. Azonosítottuk a hatást közvetítő receptor-altípusokat. (c) Elemeztük a szemcsesejtek aktivitásfüggő intracelluláris kalciumkoncentráció-változásait. Kifejlesztettünk egy olyan félautomatikus kiértékelési eljárást, ami alkalmas a neuronális kalciumtranziensek felismerésére és analízisére. (d) Feltártuk egyes muszkarinerg receptorok szerepét sejttenyészeti körülmények között fenntartott astrocyták intracelluláris kalciumkoncentráció-változásaiban. (e) Képalkotó és elektrofiziológiai módszereket alkalmazva leírtuk a nucleus cochlearisban található Purkinje-szerű neuronok sajátságait. (f) Kvantitatív morfometriai analízis segítségével azonosítottuk a pyramis- és az óriássejtek elkülönítésére legalkalmasabb paramétereket. (f) Leírtuk a tacrolimus hatását a pyramis-sejteken kialakuló posztszinaptikus áramok tulajdonságaira. (g) Feltártuk a protein-foszfatáz-1M és a Rho-kináz szerepét a bushy-sejtek és az acusticus rostok közötti szinapszis működésében. | Our aim was to assess the roles of ionic channels, modulatory mechanisms, and synaptic connections in regulating the activity of the cochlear nucleus (CN). The most important results are as follows. (a) We identified all HCN channel subunits expressed in the CN. We revealed the significance of the h-current in shaping the electrical properties and fine-tunig the synaptic connections of the giant cells. (b) We described the effects of cholinergic stimulation on the membrane properties and postsynaptic currents of the giant cells along with the identification of the receptor subtypes mediating the effects. (c) We investigated activity-related cytoplasmic calcium concentration changes of the granule neurones, and developed a semiautomatic method for the identification and evaluation of neuronal calcium transients. (d) We assessed the involvement of various muscarinergic receptors in the regulation of intracellular calcium concentration changes of cultured astrocytes. (e) Using imaging and electrophysiological techniques, we described the properties of Purkinje-like cells of the CN. (f) We identified morphological parameters that are suitable for the unambiguous discrimination between pyramidal and giant neurones. (f) We documented the effects of tacrolimus on the postsynaptic currents recorded from pyramidal neurones. (g) We revealed and described the roles of the protein-phosphatase-1M and Rho-kinase in the synaptic transmission between the bushy cells and acoustic fibers

A triadin szerepe a szarkoplazmatikus retikulumból történő kalcium-felszabadulás folyamatában harántcsíkolt izmon = The role of surface membrane and sarcoplasmic reticular proteins in acquired and hereditary muscle disorders

A szarkoplazmatikus retikulum (SR) kalcium csatornája (RyR) több fehérjével is kölcsönhatásban áll. Ide tartozik a 95 kDa-os molekulasúlyú triadint (Trisk 95), melynek alternatív splicingjával többféle molekulasúlyú izoformája jöhet létre. A Trisk 95 funkciójának felderítésére létrehozott triadin knockout (KO) egerek izmai gyengébbek és a kalciumhomeosztázisban résztvevő fehérjék expressziós szintje változott. Eredményeink szerint a triadin hiánya izom myopathiához vezethet és az általunk létrehozott állatmodellel ez jól tanulmányozható. A Trisk 95 további szerepét C2C12 izomsejteken és primer vázizomtenyészeteken tanulmányoztuk. A fehérje stabil overexpressziója csökkentette az elemi kalcium felszabadulási események (ECRE) amplitúdóját és frekvenciáját, és a depolarizáció által kiváltott Ca2+-tranzienseket. Ugyanakkor az endogén triadinexpresszió shRNS-sel történő gátlása után az ECRE-k jelentősen gyakoribbak voltak. Így feltételezhető, hogy a Trisk 95 fehérje negatívan szabályozza a RyR működését. A 32 kDa-os molekulasúlyú triadint (Trisk 32) L6.G8 myoblastokban termeltettük túl. A transzfekció nem befolyásolta a sejtek életképességét, ugyanakkor a sejtek proliferációs képessége lecsökkent. Kimutattuk a Trisk 32 és az IP3R kolokalizációját és közvetlen fizikai kapcsolatát. Funkcionális kapcsolatukat is bizonyítottuk, mivel a Trisk 32 overexpressziója szignifikánsan nagyobb amplitúdójú és felszálló meredekségű Ca2+-tranzienseket eredményezett az IP3 útvonalon keresztül. | The calcium release channel (ryanodine receptor, RyR) of the sarcoplasmic reticulum (SR) is associated with different proteins. One of them is the 95 kDa molecular weight triadin (Trisk 95) which has various isoforms with different molecular weights, all of them are splice variants of the same gene. To explore the function of Trisk 95 we generated a triadin knockout (KO) mouse which is characterized by a weaker skeletal muscle force than the control animals. Also, in case of the KO animals, the expression levels of the proteins which play role in calcium homeostasis, was changed. These results indicate that the lack of triadin can cause muscle myopathy and our animal model is suitable to investigate it. To further study the role of Trisk 95, the protein was investigated in C2C12 skeletal muscle cells and in primary skeletal muscle cultures. The constant overexpression of the protein decreased the amplitude and frequency of the elementary calcium release events (ECRE). Furthermore, the silencing of endogenous triadin expression with shRNA led to more frequent ECREs. These results suggest that Trisk 95 is a negative regulator of RyR function. Finally the 32 kDa molecular weight triadin (Trisk 32) was overexpressed in L6.G8 myoblasts. We showed the colocalization and direct physical interaction of Trisk 32 and IP3 receptor. Their functional interaction was also proved as the overexpression of Trisk 32 caused greater Ca2+-transients

PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology

Retinoids are morphogens and have been implicated in cell fate commitment of embryonic stem cells (ESCs) to neurons. Their effects are mediated by RAR and RXR nuclear receptors. However, transcriptional co-factors required for cell and gene-specific retinoid signaling are not known. Here we show that Protein aRginine Methyl Transferase (PRMT) 1 and 8 have key roles in determining retinoid regulated gene expression and cellular specification in a multistage neuronal differentiation of murine ESCs. PRMT1 acts as a selective modulator, providing the cells with a mechanism to reduce the potency of retinoid signals on regulatory "hotspots". PRMT8 is a retinoid receptor target gene itself and acts as a cell type specific transcriptional co-activator of retinoid signaling at later stages of differentiation. Lack of either of them leads to reduced nuclear arginine methylation, dysregulated neuronal gene expression and altered neuronal activity. Importantly, depletion of PRMT8 results in altered expression of a distinct set of genes, including markers of gliomagenesis. PRMT8 is almost entirely absent in human glioblastoma tissues. We propose that PRMT1 and PRMT8 serve as a rheostat of retinoid signaling to determine neuronal cell specification in a context- dependent manner, and might also be relevant in the development of human brain malignancy

Granule and Purkinje-like cells of the rat dorsal cochlear nucleus—a study using combined application of electrophysiology and imaging techniques

A nervus acusticus akcióspotenciál-mintázata a hang valamennyi érzékelhető tulajdonságát hordozza. A hallóideg aktivitásának hangérzetté való alakításáért egy olyan központi idegrendszeri hálózat felelős, ami a nucleus cochlearisszal kezdődik és a hallókéregben ér véget. A nucleus cochlearis azonban nem pusztán a központi idegrendszeri hallópályák kiinduló pontja, de ez a struktúra felelős azért is, hogy a beérkező hallási információ több, egymással párhuzamosan haladó, felszálló pályára kerüljön át. Ezen felszálló pályák egy jelentős hányada a hang egy-egy speciális tulajdonságáról közvetít információt, ami nélkülözhetetlen a hanginger jellemzőinek központi idegrendszeri rekonstrukciójához. A specifikus és intenzív kutatómunka ellenére is hézagosak az ismereteink a nucleus cochlearis és az abban található nagy számú neurontípus funkciójával kapcsolatosan. Különösen kevés adat áll rendelkezésre a mag legkisebb, ugyanakkor legnagyobb számban előforduló sejttípusáról, a szemcsesejtekről. Még ennél is kevesebbet tudunk az elsősorban a nucleus cochlearis dorsalis részében előforduló, igen jellegzetes morfológiát mutató sejttípusról, a Purkinje-szerű sejtekről (PLC). Utóbbi neuronféleség esetében még az sem ismert, hogy vajon részét képezik-e a nucleus cochlearis neuronhálózatának, vagy funkció nélküli, ectopiás Purkinje-neuronokról van szó. Jelen disszertáció patkány nucleus cochlearis dorsalis szemcse- és Purkinje-szerű sejtjeinek vizsgálatát tűzte ki célul. Kísérleteinket elektrofiziológiai és képalkotó módszerek kombinált alkalmazásával végeztük. Munkánk első részében a Purkinje-szerű sejtek morfológiai jellemzőit vizsgáltuk, amihez ezen neurontípus intenzív calbindin-pozitivitása nyújtott segítséget. Kettős immunjelölés és konfokális mikroszkópia alkalmazása után megmutattuk, hogy a PLC-k rendelkeznek a GABA bioszintéziséhez nélkülözhetetlen glutamát dekarboxilázzal. Ez a megfigyelés azt valószínűsíti, hogy a PLC-k GABAerg gátlóneuronok. Túlélő agyszelet-preparátum és teljes-sejtes patch-clamp segítségével az irodalomban elsőként írtuk le ezen sejttípus akcióspotenciál-tüzelési mintázatát. Bebizonyítottuk továbbá, hogy a Purkinje-szerű sejtek rendelkeznek a hiperpolarizáció hatására aktiválódó, nem-specifikus kationárammal (Ih). A PLC-k sejttestéről elvezetett posztisznaptikus áramok vizsgálata arra is bizonyítékot szolgáltatott, hogy a sejttípus aktív részese a DCN neuronhálózatának. Megállapítottuk, hogy a PLC-kről elvezethető gátló hatású posztszinaptikus áramok 76%-a glicinerg szinapszisok aktivitását tükrözi, míg a fennmaradó 24% GABAerg bemeneteken keresztül érkezik. Arra is rámutattunk, hogy bár a cerebellaris Purkinje-sejtekhez hasonlóan a PLC-k is erős cerebellin-1 immunpozitivitást mutatnak, a fehérje sejten belüli eloszlása különbözik a két sejtféleségben. Az egyik olyan neurontípus, aminek aktivitása jelentősen módosíthatja a nucleus cochlearis egyéb sejtjeinek – beleértve a PLC-ket is – aktivitását és működését, a cochlearis szemcsesejt. A szemcsesejtek különös jelentőségét az adja, hogy somatosensoros információ is eléri őket. Ebből kiindulva megalapozottnak tűnik az a feltételezés, hogy a szemcsesejtek alapvető jelentőségűek a somaticus és acusticus stimulusok nucleus cochlearison belüli ötvözésében. Bár léteztek arra adatok, hogy a szemcsesejtek működését kolinerg moduláció is befolyásolhatja, a jelenség részleteinek leírására ezidáig nem került sor. Ebből kiindulva munkánk második felében azt vizsgáltuk, hogy hogyan befolyásolja a szemcsesejtek intracelluláris kalciumkoncentrációját a kolinerg stimuláció. Kísérleteinket túlélő agyszeletekben elhelyezkedő, kalciumérzékeny fluoreszcens festékkel feltöltött szemcsejteken végeztük. A vizsgálatsorozat kezdetén bizonyítottuk a szemcsesejtek gyors típusú intracellularis Ca2+-jeleinek akcióspotenciál-kapcsolt voltát, majd kidolgoztunk egy módszert ezen Ca2+-jelek megbízható, automatikus azonosítására és kinetikai paramétereik jellemzésére. Megmutattuk, hogy a kolinerg stimuláció még a serkentő és gátló hatású szinaptikus transzmisszió egyidejű gátlása esetén is szignifikánsan megnöveli a szemcsesejtek aktivitását, ezáltal az általuk produkált gyors típusú Ca2+-jelek frekvenciáját. Specifikus antagonistákkal végzett kísérletekben arra is rámutattunk, hogy az általunk feltárt kolinerg hatást muszkarinos receptorok közvetítik. Bebizonyítottuk, hogy bár a szemcsesejtek mind az M1-, mind az M3-típusú muszkarinos receptort expresszálják, a funkcionális hatások kialakításáért döntően az utóbbi receptortípus aktiválódása felelős. Eredményeink hozzásegítenek annak megértéséhez, hogy a szemcse- és Purkinje-szerű sejtek hogyan illeszkednek a nucleus cochlearist felépítő neuronális hálózatba, így pontosabb képet nyerhetünk ezen bonyolult, a hallási információ központi idegrendszeri feldolgozásához nélkülözhetetlen struktúra működéséről. The action potential firing pattern of the acoustic nerve encodes all recognisable features of the sound. The conversion of the activity of the auditory nerve to acoustic sensation is carried out by a neuronal network that begins in the cochlear nucleus and terminates in the auditory cortex. The cochlear nucleus, however, is not the mere starting point of the central auditory pathways but it passes the incoming acoustic information onto several, parallel ascending pathways. A number of these pathways relay information about specific features of the sound. This arrangement is essential for the reconstruction of the overall characteristics of the auditory stimuli. This highly complicated task is carried out by the central auditory system. Despite all the intense and specific research efforts, our knowledge about the function of either the cochlear nucleus or its individual cell types is still obscure. Particularly little information is available about the granule cells that represent the smallest, yet most numerous cell type of the cochlear nucleus. Even less is known about the Purkinje-like cells (PLCs). PLCs are mostly located in the dorsal cochlear nucleus and show highly characteristic morphology. It is still not clear, for example, whether PLCs are integrant parts of the neuronal network of the cochlear nucleus or they are mere ectopic Purkinje neurons, without function. For these reasons, the present work aimed at investigating the granule neurones and the PLCs of the rat dorsal cochlear nucleus. The experiments have been carried out by combined application of electrophysiological and imaging techniques. In the first part of our work the morphological characteristics of the PLCs were investigated. This phase of our experiments exploited the intense calbindin-specific immunopositivity of the PLCs. Using double immunolabelling and confocal microscopy; we demonstrated that PLCs express glutamate-decarboxylase, an enzyme which is essential for GABA biosynthesis. This observation suggests that the PLCs are GABAergic inhibitory neurones. Using whole-cell patch-clamp in a brain slice preparation, for the first time in the literature, we revealed the action potential firing pattern of the PLCs. We showed that PLCs possess the hyperpolarisation-activated non-specific cationic current (Ih). Analysis of postsynaptic currents recorded from the somata of PLCs indicated that this cell type is an active member of the neuronal network situated in the dorsal cochlear nucleus. We showed that 76% of the inhibitory postsynaptic currents recorded from the PLCs reflect the activity of glycinergic synapses, while the remaining 24% reach the PLC bodies via GABAergic inputs. We also pointed out that although cerebellar Purkinje-neurones and PLCs are similar in terms of their strong cerebellin-1 immunopositivity, the intracellular distribution of cerebellin-1 is different in these cell types. One of the neurones whose activity may significantly modify the function of all other cell types of the dorsal cochlear nucleus — including PLCs — is the cochlear granule cell. Granule neurones are particularly important because they receive somatosensory information, too. It is reasonable to assume, therefore, that granule cells play fundamental roles in the integration of auditory and somatic stimuli within the cochlear nucleus. Although there have been data indicating that the function of the granule cells is affected by cholinergic modulation, a detailed analysis of this mechanism is yet to be performed. Consequently, in the second part of the present work, we have been studying the effects of cholinergic stimulation on the intracellular calcium concentration of the granule neurones. The experiments were carried out on calcium-sensitive fluorescent dye-loaded granule cells situated in a thin slice preparation. At the beginning of the work, we demonstrated the action potential-coupled character of the rapid calcium transients recorded from the granule cells. In the next step we introduced a method that automatically detects calcium concentration changes and determines their kinetic features. We showed that cholinergic stimulation significantly increases the activity of the granule cells and, consequently, the frequency of their rapid calcium transients — even when both excitatory and inhibitory synaptic inputs are blocked. Using specific antagonists, we demonstrated that this cholinergic influence is mediated by muscarinic receptors. We showed that although granule neurones express both M1 and M3 muscarinic receptors, the functional effects are primarily mediated by the activation of M3 receptors. Our results help us to understand better how granule neurones and PLCs are integrated into the complex neuronal network of the cochlear nucleus. Consequently, as the result of our observations, one may have more comprehensive information depicting the function of this highly complicated structure without which central processing of the auditory information would be impossible.N