Akalazya etyopatogenezinde rol oynayan epitelyal moleküllerin belirlenmesi ve epitel permeabilitenin incelenmesi

İdiyopatik akalazya nadir bir hastalıktır. Özofagusdaki peristaltizmin kaybolması ve alt özofagus sfinkterinin yeteri kadar gevşememesi hastalığın en önemli klinik bulgularıdır. Nadir bir hastalık olması nedeniyle semptomların başlangıcıyla tedavi arasında uzun bir süreç vardır. Ayrıca tanısı, benzer semptomların ortaya çıktığı gastroözofageal reflü hastalığıyla (GÖRH) büyük oranda karıştırılır. Akalazya hastalarının özofagus epitelleri, gıdaların mideye ulaşamaması sebebiyle uzun süre fermente materyallere maruz kalır ve mekanik travma oluşur. Araştırmanın amacı akalazya hastalarının epitel bariyer fonksiyon özelliklerini elektrofizyolojik ve moleküler düzeyde belirlemektir. Çalışmamızın araştırma gruplarını akalazya hastaları, tedavi sonrası akalazya hastaları, sağlıklı gönüllüler (SG) ve GÖRH (NERH (non-eroziv reflü hastalığı), ERH (eroziv reflü hastalığı)) hastaları oluşturmuştur. Tüm grupların özofagus epitellerinin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek amacıyla in-vitro Ussing çember sistemi kullanıldı. Permeabilite özellikleri florometrik ölçümler ile gerçekleştirildi. Epitel doku bütünlüğünde önemli rol oynayan sıkı bağlantı moleküllerinin ve bu moleküller ile ilişkili sinyal yolaklarına ait gen ve protein ekspresyon düzeyleri belirlendi. Gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesinde qRT-PCR yöntemi, protein düzeylerinin belirlenmesinde ise ELISA ve Multiplex ELISA yöntemleri kullanıldı. Gruplar arası elektrofizyolojik incelemeler sonucunda akalazya gruplarının elektrofizyolojik özelliklerinin SG grubuyla benzer özellik gösterdiği, GÖRH gruplarından ise transepitelyal rezistansın anlamlı olarak daha yüksek, permeabiliteninde rezistans sonucuna uyumlu olarak anlamlı düşük olduğu verisi elde edildi. Tedavi öncesi ve tedavi sonrası grupları arasında ise anlamlı fark yoktu. Akalazya gruplarının sıkı bağlantı noktaları ile ilişkili gen ekspresyon seviyeleri, hem SG'lerden hem de GÖRH gruplarından anlamlı olarak yüksek bulundu. Aynı moleküllerin protein seviyeleri incelendiğinde yalnızca TJP2 protein seviyesinin SG ve GÖRH gruplarından anlamlı yüksek olduğu sonucuna ulaşıldı. Tedavi sonrası akalazya grubunun CLDN4 seviyesi ise SG ve GÖRH gruplarına kıyasla anlamlı yüksekti. Önemli bir hücre adhezyon molekülü olan CDH1'in protein seviyesi incelendiğinde akalazya gruplarının CDH1 protein seviyelerinin ERH grubundan anlamlı yüksek olduğu belirlendi. Hücre sinyalizasyonunda önemli olduğu bilinen MAPK, PI3K/AKT/mTOR ve JAK/STAT yolakalrının akalazya hastalarında SG ve GÖRH gruplarına kıyasla daha az aktif olduğu belirlendi. Çalışmamız akalazya özofagus epitelinin elektrofizyolojik ve moleküler özelliklerinin detaylı olarak araştırıldığı ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır. Bu nedenle akalazya gibi nadir görülen bir hastalığın moleküler düzeydeki araştırmalarına katkı sağlayacağı görüşündeyiz.Idiopathic Achalasia is a rare disease. Loss of peristalsis in the esophagus and insufficient relaxation of the lower esophageal sphincter are the most important clinical findings of the disease. There is a long process between the onset of symptoms and treatment due to having low incidence. In addition, its diagnosis is highly confused with gastroesophageal reflux disease (GERD) with similar symptoms. The esophageal epithelium of Achalasia patients are exposed to the fermented materials for a long time because of the food not reaching the stomach and mechanical trauma occurs. The aim of the study is to determine the epithelial barrier function characteristics of patients with achalasia. The research groups of our study consist of the Achalasia patients, post-treatment Achalasia patients, healthy volunteers (HV) and GERD (NERH (non-erosive reflux disease), ERD (erosive reflux disease) patients. In-vitro Ussing chamber system was used to determine the electrophysiological properties of the esophageal epithelium of all groups. Permeability properties were determined by fluorometric measurements. Gene and protein expression levels of tight junction molecules that play an important role in epithelial tissue integrity and signal pathways associated with these molecules were determined. The qRT-PCR method was used to determine gene expression levels, and protein expression levels were invatigated ELISA and Multiplex ELISA methods. As a result of the electrophysiological examinations between the groups, it was concluded that the electrophysiological properties of the Achalasia groups were similar to the SG group. On the other hand the Achalasia transepithelial resistance was significantly higher than the GERD groups, and the permeability values were significantly lower. There was no significant difference between the pre-treatment and post-treatment groups. Tight junction-related gene expression levels of the Achalasia groups were significantly higher than both HV and GERD groups. Additionally, the protein levels of the same molecules were examined, it was concluded that only TJP2 protein level was significantly higher than the HV and GERD groups. The CLDN4 level of the Achalasia group after treatment was significantly higher compared to the HV and GERD groups. The protein level of CDH1, which is an important cell adhesion molecule, was examined, and CDH1 protein levels of the Achalasia groups were significantly higher than the ERH group. The gene and protein expression levels of inflammation markers in the Achalasia groups were found to be significantly higher than both HV and GERD groups. It was determined that MAPK, PI3K/AKT/mTOR and JAK/STAT pathways, which are known to be important in cell signaling, are less active in achalasia patients compared to SG and GERD groups. This study is the first to detailed investigate the electrophysiological and molecular properties of the achalasia esophageal epithelium.We believe that our study will contribute the understanding of pathogenesis of Achalasia at molecular level

Bendamustin ile indüklenen HL60 hücre serisinde apoptozun ve hücre döngüsünde görevli genlerin ekspresyon değişimlerinin belirlenmesi

Akut miyeloid lösemi (AML), hematopoetik öncül hücrelerin heterojen klonal bir hastalığıdır. Akut promiyelositer lösemi (APL), bir AML alt tipidir ve morfolojik olarak anormal promiyelositler ile karakterize edilir. APL'de görülen en belirgin kromozom düzensizliği ise 15. kromozomdaki promyelositik lösemi (PML) geni ile 17. kromozomdaki retinoik asit reseptör (RAR) alfa geninin translokasyonu sonucu bir füzyon proteini oluşturmasıdır. Bendamustin suda çözünebilen, beyaz, nitrojen hardal grubu ve bütirik asit yan zinciri bulundurması nedeniyle amfoterik özellik özellik gösteren mikrokristallin tozudur. Alkilleyici ajan olan bendamustin aynı zamanda pürin analoğu özelliği gösterir ve diğer alkilleyici ajanlara göre toksisite profili daha ılımlıdır. Çalışmadaki amacımız bendamustinin APL hücre serisi olan HL60 hücreleri üzerindeki sitotoksik, sitostatik ve apoptotik etkileri incelemekti ve hücre döngüsü, mitotik katastrof, apoptoz, DNA onarım ve Nf-mB sinyal yolağı genlerinin ilaç ile muamele sonrasındaki ekspresyon değişimleri belirlemektir. Çalışmamızda bendamustinin APL'ye model oluşturan HL60 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini WST-1 testi ile, apoptotik etkisini Annexin V ve Apo Direct Tunnel methoduyla, sitostatik etkisini ise Cycletest Plus DNA Reagent Kit ile değerlendirilmiştir. Ayrıca bendamustinin HL60 hücre serilerindeki hücre döngüsü, mitotik katastrof, apoptoz, DNA onarım ve Nf-mB sinyal yolağı genlerinin mRNA ekspresyonlarına etkisi kantitatif RT-PCR ile rölatif olarak belirlenmesidir. Bendamustinin sitotoksik etkisinin HL60 hücre serisi üzerinde yüksek dozlarda etkili olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, apoptotik etkisinin her iki yöntem ile de doza bağımlı olarak anlamlı bir şekilde arttığı belirlenmiştir. Bendamustin ile 48 saat muamele sonrasında HL-60 hücrelerinde apoptoz ile ilişkili olduğu bilinen CASP3, CASP8, CASP9 ekspresyonlarını sırasıyla 2.4, 5.7, 6.8 - kat arttırdığı saptanmıştır. Ayrıca mitotik katastrofi ile ilişkili olduğu bilinen Plk1 ekspresyonun 2.5-kat azldığını ve tümör supresör olduğu bilinen Plk2 ekspresyonunda ise 17 katlık bir artma belirlenmiştir. Sonuç olarak, bendamustinin apoptoz ve mitotik katastrof gibi hücre ölüm mekanizmaları üzerinde etkili olduğunu ve APL'nin tamamlayıcı tedavisinde kullanılabileceğini düşünmekteyiz

Determination of apoptosis and changes on cell cycle genes expressions in HL60 cell line induced with bendamustine

Amaç:Akut miyeloid lösemi (AML), hematopoetik öncül hücrelerin heterojen klonal bir hastalığıdır. Akut promiyelositer lösemi (APL), bir AML alt tipidir ve morfolojik olarak anormal promiyelositler ile karakterize edilir. APL’de görülen en belirgin kromozom düzensizliği ise 15. kromozomdaki promyelositik lösemi (PML) geni ile 17. kromozomdaki retinoik asit reseptör (RAR) alfa geninin translokasyonu sonucu bir füzyon proteini oluşturmasıdır. Bendamustin suda çözünebilen, beyaz, nitrojen hardal grubu ve bütirik asit yan zinciri bulundurması nedeniyle amfoterik özellik özellik gösteren mikrokristallin tozudur. Alkilleyici ajan olan bendamustin aynı zamanda pürin analoğu özelliği gösterir ve diğer alkilleyici ajanlara göre toksisite profili daha ılımlıdır. Bu çalışmada, bendamustinin APL hücre serisi olan HL60 hücreleri üzerindeki sitotoksik, sitostatik ve apoptotik etkileri incelenmiş ve hücre döngüsü, mitotik katastrof ve apoptoz ile ilişkili genlerinin ilaç ile muamele sonrasındaki ekspresyon değişimleri belirlenmiştir. Gereç ve yöntem: Çalışmamızda bendamustinin APL’ye model oluşturan HL60 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini WST-1 testi ile, apoptotik etkisini Annexin V ve Apo Direct Tunnel methoduyla, sitostatik etkisini ise Cycletest Plus DNA Reagent Kit ile değerlendirilmiştir. Ayrıca bendamustinin HL60 hüce serilerindeki hücre döngüsü, mitotik katastrof ve apoptoz ile ilişkili genlerinin mRNA ekspresyonlarına etkisi kantitatif RT-PCR ile rölatif olarak belirlenmiştir. Bulgular: Bendamustinin sitotoksik etkisinin HL60 hücre serisi üzerinde yüksek dozlarda etkili olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, apoptotik etkisinin her iki yöntem ile de doza bağımlı olarak anlamlı bir şekilde arttığı belirlenmiştir. Bendamustin ile 48 saat muamele sonrasında HL-60 hücrelerinde apoptoz ile ilişkili olduğu bilinen CASP3, CASP8, CASP9 ekspresyonlarını sırasıyla 2.4, 5.7, 6.8 kat arttırdığı saptanmıştır. Ayrıca mitotik katastrofi ile ilişkili olduğu bilinen Plk1 ekspresyonun 2.5 kat azaldığını ve tümör supresör olduğu bilinen Plk2 ekspresyonunda ise 17 katlık bir artma belirlenmiştir. Sonuç: Bulgularımız, bendamustinin apoptoz ve mitotik katastrof gibi hücre ölüm mekanizmaları üzerinde etkili olduğunu ve APL’ nin tamamlayıcı tedavisinde alternatif bir tedavi olarak kullanılabileceğini göstermektedir.Purpose:Acute myeloid leukemia (AML), is a heterogeneous clonal disorder of hematopoietic progenitor cells. Acute promyelocytic leukemia (APL), is a subtype of AML and characterized by aberrant morphology of promyelocytes. the most specific chromosomal disorder that occurs in APL patients is (15;17) translocation. This translocation the promyelocytic leukemia (PML) gene on chromosome 15 and the retinoic acid receptor (RAR) alpha gene on chromosome 17 fuse and produce a PML-RAR? fusion protein. Bendamustine is a water soluble, white, microcrystalline powder with amphoteric properties due to a nitrogen mustard group and a butyric acid side chain. Bendamustine acts as an alkylating agent and also has purine analog activity. Bendamustine has more moderate toxicity profile than the other alkylatingg agents. in our study, it is aimed to investigate cytotoxic, cytostatic and apoptotic effects of bendamustine on APL cell line HL60. Also we aime to evaluate the effect of bendamustine on HL60 cells according to the expression of genes including several signal transduction pathways such as; cell cycle, mitotic catastrophe and apoptosis, Materials and methods: Cytotoxic effect of bendamustine on HL60 cell line was assessed by WST-1 assay, apoptotic effect by Annexin V and Apodirect Tunnel assay and cytostatic effect by Cycletest Plus DNA Reagent Kit. Also the effect of bendamustine on expression levels of several cell cycle, mitotic catastrophe and apoptosis related genes in HL60 was determined by quantitative RT-PCR relatively. Results: We determined that bendamustine has cytotoxic effect on HL60 cell line with high-dose treatment. Also we found that Bendamustine significantly induces apoptosis in dose dependent manner and has no cytostatic effects on HL60 cells. After the 48 hours treatment with bendamustine, expression levels of apoptosis related CASP7, CASP8, CASP9 genes were upregulated 2.4, 5.7, 6.8 fold in HL60 cells, relatively. Also expressions of mitotic catastrophe related genes Plk1downregulated 2.5 fold and Plk2 which as known as tumor suppressor gene, upregulated 17 fold. Conclusion: Our data suggest that Bendamustine is effective on cell death mechanisms such as apoptosis ve mitotic catastrophe and can be used in supplement as a alternative treatment

Revealing genome-wide mRNA and microRNA expression patterns in leukemic cells highlighted “hsa-miR-2278” as a tumor suppressor for regain of chemotherapeutic imatinib response due to targeting STAT5A

BCR-ABL oncoprotein stimulates cell proliferation and inhibits apoptosis in chronic myeloid leukemia (CML). For cure, imatinib is a widely used tyrosine kinase inhibitor, but developing chemotherapeutic resistance has to be overcome. In this study, we aimed to determine differing genome-wide microRNA (miRNA) and messenger RNA (mRNA) expression profiles in imatinib resistant (K562/IMA-3 μM) and parental cells by targeting STAT5A via small interfering RNA (siRNA) applications. After determining possible therapeutic miRNAs, we aimed to check their effects upon cell viability and proliferation, apoptosis, and find a possible miRNA::mRNA interaction to discover the molecular basis of imatinib resistance. We detected that miR-2278 and miR-1245b-3p were most significantly regulated miRNAs according to miRNome array. Upregulating miR-2278 expression resulted in the inhibition of resistant leukemic cell proliferation and induced apoptosis, whereas miR-1245b-3p did not exhibit therapeutic results. Functional analyses indicated that AKT2, STAM2, and STAT5A mRNAs were functional targets for miR-2278 as mimic transfection decreased their expressions both at transcriptional and translational level, thus highlighting miR-2278 as a tumor suppressor. This study provides new insights in discovering the mechanism of imatinib resistance due to upregulating the tumor-suppressor hsa-miR-2278 which stands for a functional therapeutic approach, inhibited leukemic cell proliferation, induced apoptosis, and regain of chemotherapeutic drug response in CML therapy. © 2015, International Society of Oncology and BioMarkers (ISOBM).Ege University Research Fund (APAK 2013-TIP/083

Revealing genome-wide mRNA and microRNA expression patterns in leukemic cells highlighted “hsa-miR-2278” as a tumor suppressor for regain of chemotherapeutic imatinib response due to targeting STAT5A

BCR-ABL oncoprotein stimulates cell proliferation and inhibits apoptosis in chronic myeloid leukemia (CML). For cure, imatinib is a widely used tyrosine kinase inhibitor, but developing chemotherapeutic resistance has to be overcome. In this study, we aimed to determine differing genome-wide microRNA (miRNA) and messenger RNA (mRNA) expression profiles in imatinib resistant (K562/IMA-3 μM) and parental cells by targeting STAT5A via small interfering RNA (siRNA) applications. After determining possible therapeutic miRNAs, we aimed to check their effects upon cell viability and proliferation, apoptosis, and find a possible miRNA::mRNA interaction to discover the molecular basis of imatinib resistance. We detected that miR-2278 and miR-1245b-3p were most significantly regulated miRNAs according to miRNome array. Upregulating miR-2278 expression resulted in the inhibition of resistant leukemic cell proliferation and induced apoptosis, whereas miR-1245b-3p did not exhibit therapeutic results. Functional analyses indicated that AKT2, STAM2, and STAT5A mRNAs were functional targets for miR-2278 as mimic transfection decreased their expressions both at transcriptional and translational level, thus highlighting miR-2278 as a tumor suppressor. This study provides new insights in discovering the mechanism of imatinib resistance due to upregulating the tumor-suppressor hsa-miR-2278 which stands for a functional therapeutic approach, inhibited leukemic cell proliferation, induced apoptosis, and regain of chemotherapeutic drug response in CML therapy. © 2015, International Society of Oncology and BioMarkers (ISOBM).Ege University Research Fund (APAK 2013-TIP/083