Estudo molecular de Cepas de Leishmania (L.) Infantum Chagasi isoladas de Flebotomíneos Lu. Longipalpis de área endêmica de Leishmaniose visceral da Amazônia Brasileira

Orientadora: Profª Drª Iara de Messias ReasonCo-orientadora: Profª Drª Edna Aoba Yassui IshikawaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa: Curitiba, 17/06/2011Bibliografia: fls.56-67Área de concetração em doenças infecciosasResumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença endêmica em vários estados do Brasil. O agente etiológico é o protozoário Leishmania (L.) infantum chagasi e o principal vetor é o flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis. Estudos epidemiológicos têm utilizado a PCR convencional para mensurar a taxa de infecção de flebotomíneos, como estratégia para aumentar a sensibilidade diagnóstica. Entre as principais vantagens deste método destaca-se a sensibilidade e especificidade, independente do número, estágio e localização de Leishmania no trato digestivo do vetor. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou comparar genes com diferentes números de cópias para detectar L. chagasi em área endêmica para LV da Amazônia oriental, no município de Barcarena, estado do Pará. Foram realizadas capturas de 280 fêmeas de flebotomíneos Lu. longipalpis utilizando armadilhas de luz tipo CDC, no período de novembro de 2003 a fevereiro de 2004. O DNA foi extraído a partir do inseto inteiro, sem dissecção prévia, utilizando SDS e KOAc e empregado em reações de PCR para os genes de Leishmania: mini-exon, DNA do cinetoplasto (kDNA) e subunidade ribossomal 18S (SSU-rRNA). Foram empregados os seguintes iniciadores: D1 (5'-CCAGTTTCCCGCCCCG-3') e D2 (5'-GGGGTTGGTGTAAAATAG-3') que amplificam 780pb do gene kDNA; R221 (5'-GGTTCCTTTCCTGATTTACG-3') e R332 (5'-GGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3') que amplificam 600pb do gene da subunidade menor do ribossomo (SSU-rRNA); S1629 (5'-GGGAATTCAATAWAGTACAGAAACTG-3') e S1630 (5'-GGGAAGCTTCTGTACTWTATTGGTA-3') que amplificam 400pb do gene mini-exon. A amplificação do gene da subunidade 28S rRNA (Lu1- 5'-TGAGCTTGACTCTAGTTTGGCAC3' e Lu2 5'-AGATGTACCGCCCCAGTCAAA-3') de Lu. longipalpis foi utilizado como controle para a extração do DNA do vetor, amplificando um fragmento de aproximadamente 370pb. Do total de 280 amostras de fêmeas Lutzomyia longipalpis, 24 (8,6%) apresentaram resultados positivos para o gene kDNA; 20 (7,1%), para o gene mini-exon; e 15 (5,3%) para o gene SSU-rRNA. Assumindo o resultado da taxa de infecção natural para o kDNA, a sensibilidade dos testes para os genes mini-exon e SSU-rRNA foi de 83,3% e 63%, respectivamente. A taxa de infecção foi considerada elevada e preocupante, visto que 62,5% dos vetores infectados foram coletados no intradomicílio; 37,5%, no peridomicílio. Os dados demonstram a importância da PCR como ferramenta para investigação da epidemiologia molecular da leishmaniose visceral para a estimativa de risco de transmissão da doença em área endêmica, com maior confiabilidade para o uso do DNA do cinetoplasto do parasita como marcador.Abstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is endemic disease in the majority of states in Brazil. The causative agent of VL the protozoan Leishmania (L.) infantum chagasi and the main vector the sandfly Lutzomyia longipalpis. Epidemiological studies have used conventional PCR to measure the ratio of sandfly infection as a strategy to increase the sensitivity of VL diagnosis. The main advantage of this method is the sensitivity and specificity, regardless of number, stage and location of Leishmania in the digestive tract of the vector. The aim of the present study was to compare genes with different numbers of copies to detect L. (L.) i. chagasi in an endemic area for VL in Oriental Amazon, in Barcarena, Pará State. A total of 280 Lu. longipalpis female phlebotomine were captured using CDC light traps, from november 2003 to february 2004. The DNA was extracted from the whole insect (no dissected), using SDS and KOAc. PCR for the genes mini-exon, kinetoplast DNA (kDNA) and 18S ribosomal subunit (SSU-rRNA) of Leishmania was used. The following primers were utilized: D1 (5'-CCAGTTTCCCGCCCCG-3') and D2 (5'-GGGGTTGGTGTAAAATAG-3 ') that amplify kDNA gene 780bp; R221 (5'-GGTTCCTTTCCTGATTTACG-3 ') and R332 (5'-GGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3') that amplify 600bp of the gene of the ribosomal small subunit (SSU-rRNA); S1629 (5'-GGGAATTCAATAWAGTACAGAAACTG-3 ') and S1630 (5'-GGGAAGCTTCTGTACTWTATTGGTA-3') that amplify the 400bp mini-exon gene. The 28S rRNA gene amplification LU1 (5'-TGAGCTTGACTCTAGTTTGGCAC-3') and LU2 (5'-AGATGTACCGCCCCAGTCAAA-3') of Lu. longipalpis was used as control for extraction of vectors with amplifies a fragment of approximately 370bp. In a total of 280 samples of Lu. Longipalpis females, 24 (8.6%) were positive for the gene kDNA; 20 (7.1%) for the mini-exon gene, and 15 (5.3%) for the SSU-rRNA gene. Assuming the result of natural infection rate for the kDNA, the sensitivity of the tests for the mini-exon and SSU-rRNA genes were 83.3% and 63%, respectively. The infection rate was high and concerning, given that 62.5% of infected vectors were collected intra-household, and 37.5% in the peridomicile. These data show the importance of PCR as a tool for investigating the molecular epidemiology of VL for estimating the risk of disease transmission in endemic areas, with kinetoplast DNA showing better reliability as a marker for the parasite

Sistema complemento e adipocinas na doença de Chagas crônica

Orientadora: Prof. Dra. Iara T. de Messias-ReasonCo-orientadora: Dra. Marcia Holsbach BeltrameTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna e Ciências da Saúde. Defesa : Curitiba, 30/10/2017Inclui referências: p.132-154Resumo: A Doença de Chagas (DC) é uma doença infecciosa crônica causada pelo Trypanosoma cruzi que acomete aproximadamente cerca de 5 milhões de pessoas na América Latina. Embora a maioria dos infectados permaneça assintomática na forma indeterminada ao longo da vida, 30-40% dos pacientes podem desenvolver cardiopatia chagásica crônica (CCC). A relação de mediadores do sistema imune com o tecido adiposo tem sido reconhecida como fundamental para o entendimento do processo inflamatório em doenças cardíacas, o que torna a Pentraxina (PTX3), o Fator H (FH) e a ficolina-3 do complemento; e as adipocinas (leptina e adiponectina) potenciais marcadores de risco cardiovascular na DC crônica. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou investigar a associação entre concentrações séricas de PTX3, ficolina-3, leptina e adiponectina; e plasmáticas de FH com as formas clínicas da DC e controles, com avaliação do risco cardiovascular (RCV) a partir do Score de Framingham. Foram incluídos no estudo até 178 pacientes com DC crônica, com avaliação de prontuários para obtenção de parâmetros inflamatórios e cardiometabólicos, além de dados de eletrocardiograma e ecocardiograma; e até 208 controles. Os resultados demonstraram RCV aumentado para os pacientes com DC crônica quando comparados aos controles; assim como para a forma indeterminada quando comparada aos controles. Não foi observada diferença significativa para o RCV entre a forma indeterminada e a cardíaca, porém houve correlação positiva com a fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE). As concentrações de leptina e adiponectina apresentaram-se menores nos pacientes que nos controles, sem correlação entre as concentrações de leptina e adiponectina. Além disso, PTX3 e FH foram associados à parâmetros cardiometabólicos dos pacientes. A concentração sérica de ficolina-3 se mostrou reduzida na insuficiência cardíaca chagásica, com correlação positiva com a FEVE. Os resultados sugerem que a ativação do complemento pode ser um elo entre doença inflamatória e desordens metabólicas, com importante papel imunoregulatório da PTX3, FH, ficolina-3, leptina e adiponectina na DC crônica. Palavras-chave: Doença de Chagas. Ativação do complemento. Adipocinas.Abstract: Chagas disease (DC) is a chronic infectious disease caused by Trypanosoma cruzi that affects approximately 5 million people in Latin America. Although most infected individuals remain asymptomatic with the indeterminate form of disease throughout life, 30-40% of them may develop chronic chagasic cardiomyopathy (CCC). The interplay of the immune system with adipose tissue has been recognized as crucial for understanding the inflammatory process in cardiac diseases, being components of complement [Pentraxin (PTX3), H-Factor (FH) and ficolin-3] and adipokines (leptin and adiponectin) potential cardiovascular risk markers in CCC. The present study aimed to investigate the association between serum levels of PTX3, ficolin-3, leptin and adiponectin and plasma levels of FH with the clinical forms of CD and controls, using Framingham risk score to evaluate cardiovascular risk assessment in up to 178 patients with chronic CD and 208 controls. The clinic-laboratorial evaluation included inflammatory and cardiometabolic parameters, as well as data of electrocardiogram and echocardiogram from patients. The results demonstrated increased cardiovascular risk for patients with chronic CD when compared to controls; as well as for the indeterminate form when compared to controls. No significant difference was observed for the cardiovascular risk between the indeterminate and the CCC, but there was a positive correlation with the left ventricular ejection fraction (LVEF). Leptin and adiponectin levels were lower in patients than in the controls, with no correlation between leptin and adiponectin concentrations. In addition, PTX3 and FH were associated with cardiometabolic parameters of patients. Serum concentrations of ficolin-3 were reduced in patients with heart failure, with a positive correlation with LVEF. These results suggest that complement activation may be a link between inflammatory disease and metabolic disorders, with an important immunoregulatory role of PTX3, FH, ficolin-3, leptin and adiponectin in chronic CD. Key-words: Chagas disease. Complement activation. Adipokines

INFERRING EVOLUTIONARY RELATIONSHIPS AMONG DIFFERENT HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES FROM MULTIPLE ALIGNMENTS OF THE MAJOR CAPSID PROTEIN L1

The major capsid protein L1 constitutes the entire exterior surface of the stabilized mature human papillomavirus (HPV), mediating initial attachment to host tissues or cells, and become pliable enough to ultimately allow release of the viral genome into a new target cell. The purpose of this study was to infer evolutionary relationships among different variable-risk HPV genotypes from comparative alignments of multiple sequences of the protein L1 deposited previously in biological information database. First, sequences of the protein L1 of 20 HPV genotypes were searched and selected from a non-redundant protein sequence database UniProtKB/Swiss-Prot. Next, a phylogenetic dendogram was constructed by comparing multiple sequences of the protein L1 using molecular evolutionary genetics analyses by Mega software. The dendogram generated from comparative alignments of the L1 protein sequences of different HPV types revealed the presence of two main clusters: a first cluster containing 12 HPV types linked intimately in several sub-branches and a second cluster grouping 8 HPV types linked in another sub-branches. Evolutionary groupings generated from L1 capsid protein sequences of variable-risk HPV genotypes demonstrated weak association between pathogenicity and phylogenetic proximity in the types analyzed, accompanied by low identity among their amino acid residues. The findings described herein reveal important insights into evolutionary patterns and phylogenetic relationships among variable-risk HPV genotypes for malignant conversion of virally infected cells from multiple alignments of the major viral capsid protein L1

Balanced Scorecard aplicado em laboratórios de análises clínicas

Este artigo apresenta um modelo de Balanced Scorecard (BSC) proposto para laboratório de análises clínicas, baseado na estratégia de Kaplan e Norton, que apresenta um modelo de gestão em laboratório clínico para empresas de qualquer porte. De acordo com esse modelo, a estratégia é definida em relação a perspectivas financeiras, clientes, processos internos, aprendizado e crescimento. O BSC é um instrumento direcionado para o sistema de gestão estratégica que utiliza indicadores de desempenho baseados em variáveis capazes de interferir direta e indiretamente nas ações da empresa

Balanced Scorecard aplicado em laboratórios de análises clínicas

This article presents a model of Balanced Scorecard (BSC) proposed for clinical laboratory, based on Kaplan and Norton strategy, which presents a management model for the clinical laboratory business of any size. According to this model, strategy is defined as financial prospects, customers, internal processes, learning and growth. The BSC is an instrument directed to the strategic management system that uses performance indicators based on variables that can affect directly and indirectly in company stock.Este artigo apresenta um modelo de Balanced Scorecard (BSC) proposto para laboratório de análises clínicas, baseado na estratégia de Kaplan e Norton, que apresenta um modelo de gestão em laboratório clínico para empresas de qualquer porte. De acordo com esse modelo, a estratégia é definida em relação a perspectivas financeiras, clientes, processos internos, aprendizado e crescimento. O BSC é um instrumento direcionado para o sistema de gestão estratégica que utiliza indicadores de desempenho baseados em variáveis capazes de interferir direta e indiretamente nas ações da empresa

MENORES CONCENTRAÇÕES DE FITAS MOLDES DE DNA GENÔMICO EXTRAÍDAS A PARTIR DE MICROBIOTA RUMINAL AUMENTAM A EFICIÊNCIA DAS AMPLIFICAÇÕES IN VITRO

O presente estudo teve como objetivo maximizar a amplificação in vitro de amostras de DNA genômico extraídas a partir de micro-organismos típicos da microbiota ruminal. Diferentes concentrações de amostras de DNA genômico isoladas a partir líquido ruminal foram empregadas como fitas moldes em reações de amplificação na presença de iniciadores específicos para o gene do RNA ribossomal 16S. Um produto amplificado de aproximadamente 500pb foi visualizado em eletroforese em géis de agarose. Baixa eficiência de amplificação com a presença de produtos não-específicos de amplificação foi verificada nas PCRs realizadas na presença de DNA genômico variando de 19,2 a 40ng. Produtos de amplificação foram exclusivamente detectados com maior intensidade e alta especificidade nas amostras de DNA genômico contendo as menores quantidades de fita-molde de 0,8 a 1,6ng. Ausência de sinal de amplificação foi verificada nas reações de PCRs contendo maiores quantidades de DNA genômico variando de 98 a 200ng. Assim, amostras de DNA mais concentradas demonstraram baixa eficiência e especificidade de amplificação em comparação às amostras menos concentradas de fitas moldes. Desta forma, os resultados descritos nesse estudo evidenciam que concentrações de DNA inferiores às quantidades geralmente recomendadas nos protocolos convencionais produziram amplicon com alta especificidade nas reações de amplificação, empregando como fitas moldes DNA genômico isolado a partir de microbiota ruminal. As descobertas descritas nesse estudo apresentam uma estratégia acessível para amplificar in vitro fragmentos de DNAs genômicos ruminais provenientes de complexas comunidades microbianas

Visceral Leishmaniasis and Natural Infection Rates of Leishmania in Lutzomyia longipalpis in Latin America

Leishmaniasis, a neglected disease caused by protozoans of the Leishmania genus, is still present in 98 countries with about two million new cases yearly worldwide. It is transmitted by female phlebotomine sandflies and presents itself as cutaneous, mucocutaneous and visceral clinical forms, depending on the Leishmania species and the parasite‐host relationship. Visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, endemic in 12 countries of Latin America, with 90% of the cases reported in Brazil. VL is characterized by irregular bouts of fever, weight loss, hepatosplenomegaly and pancytopenia, being highly fatal with no treatment. The main strategy in limiting the expansion of VL, besides the treatment of human cases, is the control of the vector Lutzomyia longipalpis and its reservoirs. There are only few studies on the natural infection of Leishmania species, especially in relation to its endemic distribution. Epidemiological studies of leishmaniasis may indicate the infection rate of parasites in sandflies in order to assess the populations at risk and to direct public health control strategies. In this context, we aimed to review the main features of VL with regard the distribution of disease cases and natural infection rates of Leishmania in Lu. longipalpis in Latin America

IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS EM POPULAÇÕES NATIVAS DE LAMBARIS Astyanax sp. B DO RIO IGUAÇU (ESTADO DO PARANÁ, BRASIL) POR ANÁLISES DE AMPLIFICAÇÃO ALEATÓRIA

O objetivo deste estudo foi estimar o polimorfismo genético de populações nativas de lambaris Astyanax sp. B oriundos de quatro localidades do Rio Iguaçu (Estado do Paraná, Brasil): areal Água Azul (AA: 25º47´34´´S/50º11´34´´W), Rio Piraquara (PIR: 25º30´10´´S/49º01´25´´W), Rio Passaúna (PAS: 25015’20´´S/49025’15´´W) e Zoológico Municipal de Curitiba (ZOO: 25º33´12´´S/49º13´58´´N). Polimorfismos genéticos foram estimados a partir do DNA genômico extraído de espécimes de cada localidade na presença de primers universais em reações de amplificação aleatória PCR-RAPD. Com o auxílio do programa NTSYS versão 2.02 foram construídas matrizes de similaridade a partir do coeficiente de Jaccard (J), além da construção de um fenograma empregando o algoritmo de agrupamento UPGMA. A caracterização molecular das populações de lambaris de diferentes localizações do Rio Iguaçu demonstrou um padrão eletroforético altamente polimórfico nas análises de PCR-RAPD, totalizando 165 caracteres, sendo 157 polimórficos (95,2%) e 8 monomórficos (4,8%). O fenograma de similaridade genética gerou a separação dos indivíduos em quatro grupos distintos com indivíduos do ZOO, PAS e AA agrupados em uma similaridade variando de 27 a 90%; e os do PIR apresentando o maior distanciamento genético (25%) em relação ao demais. O uso desses marcadores permitiu caracterizar polimorfismos suficientes para discriminar populações de lambaris com intensa diferenciação genética, sem estarem fortemente conectadas por fluxo gênico nem mesmo apresentarem tendência de homogeneização genética entre as mesmas. Os resultados apresentados no presente estudo reforçam a importância do uso da técnica de PCR-RAPD como uma ferramenta eficaz para estimar a diferenciação molecular entre populações nativas de lambaris

Autoimmunity in Chronic Chagas Disease: A Road of Multiple Pathways to Cardiomyopathy?

Chagas disease (CD), a neglected tropical disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, affects around six million individuals in Latin America. Currently, CD occurs worldwide, becoming a significant public health concern due to its silent aspect and high morbimortality rate. T. cruzi presents different escape strategies which allow its evasion from the host immune system, enabling its persistence and the establishment of chronic infection which leads to the development of chronic Chagas cardiomyopathy (CCC). The potent immune stimuli generated by T. cruzi persistence may result in tissue damage and inflammatory response. In addition, molecular mimicry between parasites molecules and host proteins may result in cross-reaction with self-molecules and consequently in autoimmune features including autoantibodies and autoreactive cells. Although controversial, there is evidence demonstrating a role for autoimmunity in the clinical progression of CCC. Nevertheless, the exact mechanism underlying the generation of an autoimmune response in human CD progression is unknown. In this review, we summarize the recent findings and hypotheses related to the autoimmune mechanisms involved in the development and progression of CCC

Ficolin-1 and Ficolin-3 Plasma Levels Are Altered in HIV and HIV/HCV Coinfected Patients From Southern Brazil

The complement system is a key component of the innate immune system, participating in the surveillance against infectious agents. Once activated by one of the three different pathways, complement mediates cell lysis, opsonization, signalizes pathogens for phagocytosis and induces the adaptive immune response. The lectin pathway is constituted by several soluble and membrane bound proteins, called pattern recognition molecules (PRM), including mannose binding lectin (MBL), Ficolins-1, -2, and -3, and Collectin 11. These PRMs act on complement activation as recognition molecules of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) such as N-acetylated, found in glycoproteins of viral envelopes. In this study, Ficolin-1 and Ficolin-3 plasma levels were evaluated in 178 HIV patients (93 HIV; 85 HIV/HCV) and 85 controls from southern Brazil. Demographic and clinical-laboratory findings were obtained during medical interview and from medical records. All parameters were assessed by logistic regression, adjusted for age, ancestry, and sex. Significantly lower levels of Ficolin-1 were observed in HIV/HCV coinfected when compared to HIV patients (p = 0.005, median = 516 vs. 667 ng/ul, respectively) and to controls (p < 0.0001, 1186 ng/ul). Ficolin-1 levels were lower in males than in females among HIV patients (p = 0.03) and controls (p = 0.0003), but no association of Ficolin-1 levels with AIDS was observed. On the other hand, Ficolin-3 levels were significantly lower in controls when compared to HIV (p < 0.0001, medians 18,240 vs. 44,030 ng/ml, respectively) and HIV/HCV coinfected (p < 0.0001, 40,351 ng/ml) patients. There was no correlation between Ficolin-1 and Ficolin-3 levels and age, HIV viral load or opportunistic infections. However, Ficolin-3 showed a positive correlation with T CD4 cell counts in HIV monoinfected patients (p = 0.007). We provide here the first assessment of Ficolin-1 and−3 levels in HIV and HIV/HCV coinfected patients, which indicates a distinct role for these pattern recognition molecules in both viral infections