Análise genotípica de cepas de noravírus provenientes de Manaus, Amazonas, no periódo de 2010-2014

Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Resumo: Mundialmente, os norovírus (NoV) constituem uma das principais causas de gastrenterite aguda (GA). Durante os últimos anos, têm-se observado a ascensão desses vírus como agentes causadores de diarreia, sendo atualmente a segunda maior causa de GA viral em crianças e o principal responsável por surtos de diarreia não-bacterianos. O objetivo deste estudo foi realizar a genotipagem e caracterização filogenética dos NoV detectados em amostras fecais de crianças com GA provenientes da cidade de Manaus, Amazonas, durante o período de janeiro de 2010 a dezembro de 2014. Neste trabalho, foram analisadas amostras fecais positivas para NoV pelo ensaio imunoenzimático (EIE). Primeiramente, foi realizada a Reação em Cadeia da Polimerase Precedida de Transcrição Reversa (RT-PCR) para as regiões B da polimerase e D do capsídeo viral, utilizando os iniciadores Mon 431/432/433/434 e Cap C, D1 e D3, respectivamente. Vinte por cento das amostras caracterizadas como genótipo GII.4 foram testadas e sequenciadas também com os iniciadores EVP2F/EVP2R específicos para a região P2 do capsídeo viral. Nas amostras com genótipos discordantes quando comparadas as regiões da polimerase e do capsídeo (D), sugestivas de recombinação, foi realizada uma PCR para sequenciamento da região de junção da ORF1-ORF2 utilizando os iniciadores Mon 431 e G2SKR. As análises filogenéticas foram realizadas por MáximaVerossimilhança utilizando-se o programa IQTree v.1.3.0 com 1000 réplicas de bootstrap. Edições nas árvores filogenéticas foram feitas com o programa FigTree v.1.4.2 e as análises dos epítopos da região P2 no programa MEGA 6. As análises de recombinação foram realizadas com as configurações padrões do programa SimPlot (v.3.5.1). Durante os anos de 2010 a 2014, os NoV foram detectados em 33,1% (349/1053) das amostras testadas pelo EIE. Dentre estas, 250 foram testadas por RT-PCR e 75,6% (189) amplificaram por pelo menos uma região do genoma, permitindo a genotipagem. A análise filogenética demonstrou os seguintes genótipos: GII.Pe/GII.4 Sydney_2012, GII.P4/GII.4 New Orleans_2009, GII.P8/GII.8, GII.P12/GII.12, GII.P15/GII.15, GI.P5/GI.5, GII.P4_US95_96/NG, além das cepas recombinantes GII.P7/GII.6, GII.P22/GII.5, GII.Pg/GII.1, GII.Pg/GII.12. O genótipo mais frequente foi o GII.4, na forma de suas variantes Sydney_2012 e New Orleans_2009, as quais foram responsáveis por 52,4% (99/189) dos casos. Nos anos de 2010 e 2011, observouse a circulação da cepa GII.P4/GII.4 New Orleans_2009 em maior frequência. A partir de junho de 2012, essa cepa foi substituída pela cepa Sydney_2012, a qual predominou até o final do estudo em 2014. A análise da região P2 demonstrou que nove cepas New Orleans_2009 apresentavam mudanças aminoacídicas no aminoácido (AA) 294 localizado no epítopo A e duas no AA 413 no epítopo E. Nas cepas Sydney_2012 foram identificadas cinco mudanças nos AA nos epítopos antigênicos, são elas: 297 e 372 (epítopo A), 340 (epítopo C), 393 (epítopo D) e 412 (epítopo E). Ressalta-se a importância de dar continuidade a estudos epidemiológicos e moleculares como este, a fim de se monitorar a incidência desse patógeno na população, bem como identificar os genótipos circulantes, uma vez que os NoV sofrem frequentemente eventos de mutação e recombinação

High prevalence of norovirus in children with sporadic acute gastroenteritis in Manaus, Amazon Region, northern Brazil

Universidade do Estado do Pará. Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária na Amazônia. Belém, PA, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Programa de Pós-Graduação em Virologia. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Programa de Pós-Graduação em Virologia. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil.BACKGROUND: Norovirus (NoV) is a major cause of acute gastroenteritis (AGE) worldwide, especially in children under five years. Studies involving the detection and molecular characterisation of NoV have been performed in Brazil, demonstrating its importance as an etiological agent of AGE. OBJECTIVES: The objectives of this study were to investigate the frequency of human NoV and to genotype the strains isolated from 0-14-year-old patients of AGE in Manaus, Brazil, over a period of two years. METHODS: A total of 426 faecal samples were collected between January 2010 and December 2011. All samples were tested for the presence of NoV antigens using a commercial enzyme immunoassay kit. RNA was extracted from all faecal suspensions and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the NoV-polymerase partial region was performed as a trial test. Positive samples were then subjected to PCR with specific primers for partial capsid genes, which were then sequenced. FINDINGS: NoV was detected in 150 (35.2%) faecal samples, for at least one of the two techniques used. NoV was detected in children from all age groups, with the highest positivity observed among the group of 1-2 years old. Clinically, fever was verified in 43% of the positive cases and 46.3% of the negative cases, and vomiting was observed in 75.8% and 70.8% cases in these groups, respectively. Monthly distribution showed that the highest positivity was observed in January 2010 (81.2%), followed by February and April 2010 and March 2011, when the positivity rate reached almost 50%. Phylogenetic analyses performed with 65 positive strains demonstrated that 58 (89.2%) cases of NoV belonged to genotype GII.4, five (7.7%) to GII.6, and one (1.5%) each to GII.7 and GII.3. MAIN CONCLUSIONS: This research revealed a high circulation of NoV GII.4 in Manaus and contributed to the understanding of the importance of this virus in the aetiology of AGE cases, especially in a region with such few studies available

Norovirus diversity in diarrheic children from an African-descendant settlement in Belém, Northern Brazil.

Norovirus (NoV), sapovirus (SaV) and human astrovirus (HAstV) are viral pathogens that are associated with outbreaks and sporadic cases of gastroenteritis. However, little is known about the occurrence of these pathogens in relatively isolated communities, such as the remnants of African-descendant villages ("Quilombola"). The objective of this study was the frequency determination of these viruses in children under 10 years, with and without gastroenteritis, from a "Quilombola" Community, Northern Brazil. A total of 159 stool samples were obtained from April/2008 to July/2010 and tested by an enzyme immunoassay (EIA) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect NoV, SaV and HAstV, and further molecular characterization was performed. These viruses were detected only in the diarrheic group. NoV was the most frequent viral agent detected (19.7%-16/81), followed by SaV (2.5%-2/81) and HAstV (1.2%-1/81). Of the 16 NoV-positive samples, 14 were sequenced with primers targeting the B region of the polymerase (ORF1) and the D region of the capsid (ORF2). The results showed a broad genetic diversity of NoV, with 12 strains being classified as GII-4 (5-41.7%), GII-6 (3-25%), GII-7 (2-16.7%), GII-17 (1-8.3%) and GI-2 (1-8.3%), as based on the polymerase region; 12 samples were classified, based on the capsid region, as GII-4 (6-50%, being 3-2006b variant and 3-2010 variant), GII-6 (3-25%), GII-17 (2-16.7%) and GII-20 (1-8.3%). One NoV-strain showed dual genotype specificity, based on the polymerase and capsid region (GII-7/GII-20). This study provides, for the first time, epidemiological and molecular information on the circulation of NoV, SaV and HAstV in African-descendant communities in Northern Brazil and identifies NoV genotypes that were different from those detected previously in studies conducted in the urban area of Belém. It remains to be determined why a broader NoV diversity was observed in such a semi-isolated community

Monthly distribution of the positive cases of norovirus, sapovirus and astrovirus (including their genotypes) detected in stool specimens from diarrheic children of the Abacatal “Quilombola” Community, Pará State, Brazil.

<p>April/2008 to July/2010.</p

Dendograms constructed using the partial region of the norovirus RNA polymerase sequence (ORF1-B) (A) and capsid region (ORF2-D) (B) amplified from 14 strains from diarrheic children of Abacatal “Quilombola” Community, metropolitan region of Belém, Pará State, Brazil.

<p>April/2008 to July/2010. Prototype strains are presented together with strains from other locations. The number above each branch corresponds to the bootstrap value (2,000 replicates). The scale bar is proportional to the genetic distance. Study samples were marked (♦): PA-local/Qui-code in the study+F_x-Number of the stool/country/month+year of collection.</p

Map showing the location of the Abacatal “Quilombola” Community, in the metropolitan region of Belém city, Pará State, Amazon region, Brazil.

<p>Map showing the location of the Abacatal “Quilombola” Community, in the metropolitan region of Belém city, Pará State, Amazon region, Brazil.</p