Die Biosynthese und der Transport von N-Acetylaspartylglutamat und N-Acetylaspartylglutamylglutamat

N-Acetylaspartylglutamat (NAAG) ist eines der höchst konzentrierten Neuropeptide im Nervensystem von Säugetieren. Neben der postulierten Rolle als Agonist für den Typ II metabotropen Glutamatrezeptor 3. Zusätzlich dient es als Transportmittel für freies Glutamat und als molekulare Wasserpumpe. Der NAAG Metabolismus ist bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt. Die NAA Synthase (Nat8l) katalysiert die N-Acetylierung von Aspartat zu N-Acetylaspartat (NAA). NAAG wird in spezifischen Neuronen durch eine Synthetase in einer Kondensationsreaktion aus NAA und Glutamat synthetisiert. NAAG wird aus den Synapsen durch synaptische Vesikel freigesetzt. Die Aufnahme in die synaptischen Vesikel findet durch einen bisher unbekannten Transporter statt. NAAG wird dann extrazellulär durch Glutamat Carboxypeptidase II (GCP-II) hydrolysiert. Es sind zwei NAAG-Synthetasen bekannt, die Synthetase I (NAAGS-I) und die Synthetase II (NAAGS-II). In dieser Arbeit wurde die Funktion der NAAGS-II genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die NAAGS-II neben NAAG ein weiteres, bisher noch nicht beschriebenes Peptid, das N-Acetylglutamylglutamat (NAAG2) synthetisiert. NAAG2 konnte mit einer neu etablierten massenspektrometrischen Methode im murinen Nervensystem nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Menge an NAAG2 ist dabei um ein zehn- bis zwanzigfaches niedriger als die Menge an NAAG. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass in den NAAGS-II defizienten Mäusen kein NAAG2 mehr vorhanden ist. In altersabhängigen Studien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Expression der Synthetasen unterscheidet. Die NAAGS-I spielt eine größere Rolle im embryonalen und frühen postnatalen Alter, wohingegen die NAAGS-II erst im Alter von 10 Tage alten Tieren an Bedeutung gewinnt. Dieses zeigt sich auch in den Konzentrationen der Peptide im Vergleich von wt und NAAGS-II defizienten Tieren. Patienten mit der SALLA Erkrankung, die durch eine Mutation im SLC17A5 Gen hervorgerufen wird, zeigen erhöhte Konzentrationen von NAAG im Liquor. Das Gen SLC17A5 kodiert Sialin, den lysosomalen Transporter für N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure). Da gezeigt wurde, dass Sialin in synaptischen Vesikeln vorkommt, es den vesikulären Transport von Aspartat und Glutamat katalysiert und in der SALLA Erkrankung eine Erhöhung an NAAG zu finden ist, stellte sich die Frage ob Sialin auch den vesikulären Transport von NAAG katalysieren könnte. Es wurde der Transport von NAAG in Mikrovesikel von wildtyp und Sialin defizienten Mäusen untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass NAAG ATP-abhängig nur in wildtyp Vesikel transportiert wird. Es konnte außerdem mit einem Zelltransportversuch und Transportversuchen mit Sialin haltigen Proteoliposomen gezeigt werden, dass NAAG nur in Anwesenheit von Sialin aufgenommen wird. Damit wurde gezeigt, dass Sialin höchstwahrscheinlich der NAAG Transporter für die Aufnahme in synaptische Vesikel ist. In dieser Arbeit konnten wichtige Aspekte des postulierten trizellulären Metabolismus von NAAG aufgeklärt werden

N-Acetylaspartylglutamate Synthetase II Synthesizes N-Acetylaspartylglutamylglutamate

N-Acetylaspartylglutamate (NAAG) is found at high concentrations in the vertebrate nervous system. NAAG is an agonist at group II metabotropic glutamate receptors. In addition to its role as a neuropeptide, a number of functions have been proposed for NAAG, including a role as a non-excitotoxic transport form of glutamate and a molecular water pump. We recently identified a NAAG synthetase (now renamed NAAG synthetase I, NAAGS-I), encoded by the ribosomal modification protein rimK-like family member B (Rimklb) gene, as a member of the ATP-grasp protein family. We show here that a structurally related protein, encoded by the ribosomal modification protein rimK-like family member A (Rimkla) gene, is another NAAG synthetase (NAAGS-II), which in addition, synthesizes the N-acetylated tripeptide N-acetylaspartylglutamylglutamate (NAAG2). In contrast, NAAG2 synthetase activity was undetectable in cells expressing NAAGS-I. Furthermore, we demonstrate by mass spectrometry the presence of NAAG2 in murine brain tissue and sciatic nerves. The highest concentrations of both, NAAG2 and NAAG, were found in sciatic nerves, spinal cord, and the brain stem, in accordance with the expression level of NAAGS-II. To our knowledge the presence of NAAG2 in the vertebrate nervous system has not been described before. The physiological role of NAAG2, e.g. whether it acts as a neurotransmitter, remains to be determined