CXCR4/CXCL12 Participate in Extravasation of Metastasizing Breast Cancer Cells within the Liver in a Rat Model

INTRODUCTION: Organ-specific composition of extracellular matrix proteins (ECM) is a determinant of metastatic host organ involvement. The chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 play important roles in the colonization of human breast cancer cells to their metastatic target organs. In this study, we investigated the effects of chemokine stimulation on adhesion and migration of different human breast cancer cell lines in vivo and in vitro with particular focus on the liver as a major metastatic site in breast cancer. METHODS: Time lapse microscopy, in vitro adhesion and migration assays were performed under CXCL12 stimulation. Activation of small GTPases showed chemokine receptor signalling dependence from ECM components. The initial events of hepatic colonisation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were investigated by intravital microscopy of the liver in a rat model and under shRNA inhibition of CXCR4. RESULTS: In vitro, stimulation with CXCL12 induced increased chemotactic cell motility (p,0.05). This effect was dependent on adhesive substrates (type I collagen, fibronectin and laminin) and induced different responses in small GTPases, such as RhoA and Rac-1 activation, and changes in cell morphology. In addition, binding to various ECM components caused redistribution of chemokine receptors at tumour cell surfaces. In vivo, blocking CXCR4 decreased extravasation of highly metastatic MDA-MB-231 cells (p < 0.05), but initial cell adhesion within the liver sinusoids was not affected. In contrast, the less metastatic MDA-MB-468 cells showed reduced cell adhesion but similar migration within the hepatic microcirculation. CONCLUSION: Chemokine-induced extravasation of breast cancer cells along specific ECM components appears to be an important regulator but not a rate-limiting factor of their metastatic organ colonization.Claudia Wendel, André Hemping-Bovenkerk, Julia Krasnyanska, Sören Torge Mees, Marina Kochetkova, Sandra Stoeppeler and Jörg Haie

DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Beitrags der zur Verfügung stehenden Wege und deren Regulation bei der Reparatur der strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüche (DSBs) im DT40‐Zellsystem. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen der beiden klassischen DNA‐Doppelstrangbruch‐Reparaturwege, c‐NHEJ (canonical non‐homologous end‐joining) und HR (homologous recombination) durch den Zellzyklus untersucht. Anhand von WT und Reparaturmutanten, die einen Defekt im c‐NHEJ (Ku70‐/‐) bzw. in der HR (Rad54‐/‐) oder in beiden Reparaturwegen (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) aufweisen,wurden das klonogene Überleben und die Reparatur genauer analysiert. Mithilfe der Überlebensexperimente mit exponentiell wachsenden Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen der Doppelmutante (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) die strahlenempfindlichste Zelllinie darstellen,was die Wichtigkeit der beiden Reparaturwege für das Überleben nach ionisierender Strahlung unterstreicht. Die Zellen der HR‐Mutante (Rad54‐/‐) zeigten eine moderate Strahlenempfindlichkeit.Interessanterweise wies die Überlebenskurve der c‐NHEJ‐Mutante (Ku70‐/‐) ein biphasisches Verhalten auf, welches sich bei niedrigen Dosen (bis 2 Gy) in einer Strahlensensitivität, bei höheren Strahlendosen (4‐10 Gy) jedoch in einer Strahlenresistenz gegenüber dem WT äußerte. Die in dieser Arbeit etablierte Messung der Zellzyklusphasenabhängigen Reparatur in DT40‐Zellen unterstützte nur partiell das aus dem Säugetierzellsystem bekannte Reparaturmodell und das biphasische Verhalten der Ku70‐/‐‐Mutante im Überlebensexperiment. Analysen der γH2AX‐Foci zeigten, dass auch im DT40‐Zellsystem das c‐NHEJ der dominante Weg für die in der G1‐Phase bestrahlten Zellen ist. Die Reparaturstudien der in der G2‐Phase bestrahlten Zellen verdeutlichen, dass trotz der hohen HR‐Frequenz in den DT40‐Zellen, das c‐NHEJ den größeren Anteil an DSBs als der Vorgang der HR beseitigt.Um einen genaueren Einblick in den Beitrag der jeweiligen Reparaturwege nach Bestrahlung in der S‐Phase zu gewinnen, wurden S‐Phase Zellen anhand spezifischer EdU-Muster in drei Untergruppen (frühe, mittlere und späte S) unterteilt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der frühen S‐Phase bestrahlten Zellen das c‐NHEJ bevorzugt nutzen, während für die in der mittleren und späten S‐Phase bestrahlte Zellen die HR der dominierende Schritt in der Reparatur ist. Aufgrund der verbesserten Reparatur der in der mittleren SPhase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante im Vergleich zum WT, wurde angenommen,dass das c‐NHEJ für diese Zellzyklusphase keine Rolle spielt. Aufgrund der Restreparatur in der Doppelmutante konnte der Einfluss eines zusätzlichen Reparaturweges wie eines A‐EJ (alternative end‐joinig)‐Mechanismus in den DT40‐Zellen nicht ausgeschlossen werden. Die Reparaturstudien ließen vermuten, dass die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante aufgrund ihres gegenüber dem WT vorhandenen Reparaturvorteils zur verbesserten Überlebensfähigkeit beitragen. Für die Überprüfung dieser Annahme wurden die Zellzyklusphasen‐spezifische Überlebensfähigkeit und die Reparaturmessungen in synchronisierten Zellen betrachtet. Aus diesem Experiment wurde ersichtlich, dass die in der späten S/G2‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante trotz eines Reparaturdefektes eine besserere Überlebensfähigkeit als der WT aufweisen. Die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante zeigen dagegen trotz des Reparaturvorteils eine im Vergleich zum WT deutlich niedrigere Überlebensrate. Diese sich widersprechenden Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Qualität der Reparatur ein entscheidender Faktor für die Überlebensfähigkeit der Zelle ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des Proteins Artemis während der DSB-Reparatur genauer untersucht. Aus Studien mit Säugetierzellen ist bekannt, dass Artemis-defiziente Zellen empfindlich auf Strahlung reagieren und dass Artemis zusammen mit ATM an der langsamen Reparaturkomponente von strahleninduzierten DSBs sowohl in der G1‐ als auch in der G2‐Phase beteiligt ist. In der G1‐Phase beteiligt sich Artemis am c‐NHEJ. In der G2‐Phase ist es während der HR für die Reparatur heterochromatischer DSBs verantwortlich. In den Überlebensexperimenten mit DT40‐Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Artemis‐defiziente Zelllinien strahlenempfindlich sind. Mithilfe der γH2AX‐Foci‐Analyse wurde festgestellt, dass Artemis während der Reparatur nach Bestrahlung in der G1, G2,sowie in der frühen und der späten S‐Phase wichtig ist. Dagegen läuft die Reparatur der in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen in der Abwesenheit von Artemis schneller als im WT ab, was die chromosomalen Studien ebenfalls unterstützen. Die Reparatur in den Ku70‐/‐/Art‐/‐‐ sowie Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutanten verläuft nahezu in allen Zellzyklusphasen besser als in den Ku70‐/‐‐ und Rad54‐/‐‐Einzelmutanten. Die Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutante bildet jedoch in der G1‐Phase einen mit der Art‐/‐‐defizienten Zelllinie vergleichbaren Reparaturdefekt aus. Das Aufheben der Reparaturdefekte in der c‐NHEJ‐ und HR‐Mutante durch die Artemis‐Deletion deutet daraufhin, dass die DSBs ungehindert über alternative Mechanismen repariert werden. Diese werden insbesondere aktiviert, wenn klassische Reparaturwege fehlen. Somit scheint Artemis eine neue Funktion auszuführen, indem es als ein molekularer Schalter die Wahl der Reparaturwege, c‐NHEJ, HR und A‐EJ‐Mechanismen regelt

DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Beitrags der zur Verfügung stehenden Wege und deren Regulation bei der Reparatur der strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüche (DSBs) im DT40‐Zellsystem. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen der beiden klassischen DNA‐Doppelstrangbruch‐Reparaturwege, c‐NHEJ (canonical non‐homologous end‐joining) und HR (homologous recombination) durch den Zellzyklus untersucht. Anhand von WT und Reparaturmutanten, die einen Defekt im c‐NHEJ (Ku70‐/‐) bzw. in der HR (Rad54‐/‐) oder in beiden Reparaturwegen (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) aufweisen,wurden das klonogene Überleben und die Reparatur genauer analysiert. Mithilfe der Überlebensexperimente mit exponentiell wachsenden Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen der Doppelmutante (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) die strahlenempfindlichste Zelllinie darstellen,was die Wichtigkeit der beiden Reparaturwege für das Überleben nach ionisierender Strahlung unterstreicht. Die Zellen der HR‐Mutante (Rad54‐/‐) zeigten eine moderate Strahlenempfindlichkeit.Interessanterweise wies die Überlebenskurve der c‐NHEJ‐Mutante (Ku70‐/‐) ein biphasisches Verhalten auf, welches sich bei niedrigen Dosen (bis 2 Gy) in einer Strahlensensitivität, bei höheren Strahlendosen (4‐10 Gy) jedoch in einer Strahlenresistenz gegenüber dem WT äußerte. Die in dieser Arbeit etablierte Messung der Zellzyklusphasenabhängigen Reparatur in DT40‐Zellen unterstützte nur partiell das aus dem Säugetierzellsystem bekannte Reparaturmodell und das biphasische Verhalten der Ku70‐/‐‐Mutante im Überlebensexperiment. Analysen der γH2AX‐Foci zeigten, dass auch im DT40‐Zellsystem das c‐NHEJ der dominante Weg für die in der G1‐Phase bestrahlten Zellen ist. Die Reparaturstudien der in der G2‐Phase bestrahlten Zellen verdeutlichen, dass trotz der hohen HR‐Frequenz in den DT40‐Zellen, das c‐NHEJ den größeren Anteil an DSBs als der Vorgang der HR beseitigt.Um einen genaueren Einblick in den Beitrag der jeweiligen Reparaturwege nach Bestrahlung in der S‐Phase zu gewinnen, wurden S‐Phase Zellen anhand spezifischer EdU-Muster in drei Untergruppen (frühe, mittlere und späte S) unterteilt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der frühen S‐Phase bestrahlten Zellen das c‐NHEJ bevorzugt nutzen, während für die in der mittleren und späten S‐Phase bestrahlte Zellen die HR der dominierende Schritt in der Reparatur ist. Aufgrund der verbesserten Reparatur der in der mittleren SPhase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante im Vergleich zum WT, wurde angenommen,dass das c‐NHEJ für diese Zellzyklusphase keine Rolle spielt. Aufgrund der Restreparatur in der Doppelmutante konnte der Einfluss eines zusätzlichen Reparaturweges wie eines A‐EJ (alternative end‐joinig)‐Mechanismus in den DT40‐Zellen nicht ausgeschlossen werden. Die Reparaturstudien ließen vermuten, dass die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante aufgrund ihres gegenüber dem WT vorhandenen Reparaturvorteils zur verbesserten Überlebensfähigkeit beitragen. Für die Überprüfung dieser Annahme wurden die Zellzyklusphasen‐spezifische Überlebensfähigkeit und die Reparaturmessungen in synchronisierten Zellen betrachtet. Aus diesem Experiment wurde ersichtlich, dass die in der späten S/G2‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante trotz eines Reparaturdefektes eine besserere Überlebensfähigkeit als der WT aufweisen. Die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante zeigen dagegen trotz des Reparaturvorteils eine im Vergleich zum WT deutlich niedrigere Überlebensrate. Diese sich widersprechenden Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Qualität der Reparatur ein entscheidender Faktor für die Überlebensfähigkeit der Zelle ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des Proteins Artemis während der DSB-Reparatur genauer untersucht. Aus Studien mit Säugetierzellen ist bekannt, dass Artemis-defiziente Zellen empfindlich auf Strahlung reagieren und dass Artemis zusammen mit ATM an der langsamen Reparaturkomponente von strahleninduzierten DSBs sowohl in der G1‐ als auch in der G2‐Phase beteiligt ist. In der G1‐Phase beteiligt sich Artemis am c‐NHEJ. In der G2‐Phase ist es während der HR für die Reparatur heterochromatischer DSBs verantwortlich. In den Überlebensexperimenten mit DT40‐Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Artemis‐defiziente Zelllinien strahlenempfindlich sind. Mithilfe der γH2AX‐Foci‐Analyse wurde festgestellt, dass Artemis während der Reparatur nach Bestrahlung in der G1, G2,sowie in der frühen und der späten S‐Phase wichtig ist. Dagegen läuft die Reparatur der in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen in der Abwesenheit von Artemis schneller als im WT ab, was die chromosomalen Studien ebenfalls unterstützen. Die Reparatur in den Ku70‐/‐/Art‐/‐‐ sowie Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutanten verläuft nahezu in allen Zellzyklusphasen besser als in den Ku70‐/‐‐ und Rad54‐/‐‐Einzelmutanten. Die Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutante bildet jedoch in der G1‐Phase einen mit der Art‐/‐‐defizienten Zelllinie vergleichbaren Reparaturdefekt aus. Das Aufheben der Reparaturdefekte in der c‐NHEJ‐ und HR‐Mutante durch die Artemis‐Deletion deutet daraufhin, dass die DSBs ungehindert über alternative Mechanismen repariert werden. Diese werden insbesondere aktiviert, wenn klassische Reparaturwege fehlen. Somit scheint Artemis eine neue Funktion auszuführen, indem es als ein molekularer Schalter die Wahl der Reparaturwege, c‐NHEJ, HR und A‐EJ‐Mechanismen regelt

Flow cytometry analysis of breast cancer cells.

<p>The cell surface expression of CXCR4 (⁃) was found in different breast cancer cell lines MDA-MB-231 (a) and MDA-MB-468 (b). Downregulation of CXCR4 expression in clones MDA-MB-231 Cl 19 (c) and MDA-MB-231 Cl 27 (d). (isotype control IgG2b: ••••; negative control:▪).</p

Kinetics of CXCR4 cell surface expression.

<p>MDA-MB-231 cells were seeded at C I (left column) or FN (right column) and stimulated with CXCL12 for up to 30 min. Fixed cells without stimulation (a+b) or with CXCL12 stimulation (25 ng/ml) for 5 min (c+d), 15 min. (e+f) or 30 min (g+h) were stained for surface expression of CXCR4. The number of large CXCR4 clusters was reduced after 30 at cells in a comparable manner for both ECM components. Scale 10 µm</p

Clustering of CXCR4 at tumour cell surfaces.

<p>CXCR4 was visualized in wild-type MDA-MB-231 cells using fluorescence-labelled antibodies (red). Nuclei were counterstained (blue). Scale 50 µm. Figures were taken 15 min after CXCL12 stimulation and merged with phase-contrast for cellular location of the CXCR4. In both cell lines similar distributions of CXCR4 were observed. MDA-MB-231 cells at C I (a+b; as integrin dependent) and PLL (c+d; as integrin independent control) are shown as examples. Cell spreading at ECM components induced formation of large CXCR4 clusters at lamellipodia and pseudopodia (a), whereas in cells adherent at PLL only small dot-like CXCR4 clusters were observed (c). Presence of 25 ng/ml CXCL12 (C I: b, PLL: d) did not result in alterations of the size or localization of these clusters. (e) The sizes of 20 clusters in at least 10 cells per experiment were evaluated for each adhesive substrate. Areas (µm²) of these clusters (▪) and their circumference (µm, □) were significantly higher in cells that were spread in an integrin-dependent manner at C I, FN or LN compared to unspread cells at PLL (* p<0.001; +p<0.05). (f) Larger clusters (▸) and dot-like CXCR4 structures (→) were found with a preference of the dot-like structures in the direct neighbourhood of leading adhesive boundaries.</p

CXCL12 stimulated cell adhesion and migration.

<p>Transwell migration assays were performed for 16 h using different gradients of CXCL12 (0–100 ng/ml). (a) Bell-shaped response is shown for MDA-MB-231 cells at C I. (b) This response was specific for CXCL12 and could be reversed by inhibitory anti-CXCR4 antibodies in these cells. A slight agonistic effect of the anti-CXCR4-mAb was observed. (c) In MDA-MB-231 cells this response (25 ng/ml CXCL12) occurred at all ECM components, but to different extent. (d) In contrast, in MDA-MB-468 cells stimulated migration (25 ng/ml CXCL12) was found at C I and FN, but not at LN. The values are reported as means ± SD of three independent experiments (* p<0.001 and +p<0.05). Cell adhesion: (e) MDA-MB-231 and (f) MDA-MB-468 cells were plated at C I (▪), FN (≡), LN (□). Binding to BSA coated surfaces was used as background control. Cells were treated with 25, 50 or 100 ng/ml CXCL12 or left untreated (0 ng/ml). After 30 min adhesion time absorbance was measured as optical density (OD) at 630 nm. CXCL12 did not significantly modify cell adhesion of both cell lines, but adhesion properties were depended from the adhesive substrates with high adhesion rates at C I and FN compared to low or absent adhesion at LN.</p

Cell surface expression of chemokines receptors.

<p>Cell surface expression was analysed by flow cytometry. shRNA transfection resulted in a reduction of CXCR4 expression in MDA-MB231-27 cells. Negative and IgG controls are given as examples for the controls that have been used in each measurement. IgG controls were subtype-specific.</p

Expression of integrin subunits at cell surfaces.

<p>Cell surface expression was analysed by flow cytometry. The major difference between the cells was observed for integrin ligands of LN. Negative and IgG controls are given as examples for the controls that have been used in each measurement. IgG controls were subtype-specific.</p