Multiplex-RT-PCR-sovellusten kehittäminen kasvivirusdiagnostiikkaa varten ja virusten tunnistaminen siRNA-analyysillä

Multiplex-PCR-menetelmässä käytetään samassa reaktiossa useita, eri DNA-jaksoille spesifisiä alukkeita, mikä mahdollistaa esimerkiksi useiden eri virusten tai virusryhmien tunnistamisen samalla PCR-reaktiolla. Uuden laaja-alaisen kasvivirusten tunnistusmenetelmän, siRNA-analyysin, odotetaan edistävän kasvivirusten tunnistamista, sillä se ei vaadi ennakko-oletusta näytteessä mahdollisesti esiintyvistä viruksista. Menetelmän ansiosta testattavien virusten rajaukset käyvät tarpeettomiksi. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli optimoida Eviran (nyk. Ruokavirasto) kasvintuhoojalaboratoriolle kaksi tai useampi yksivaiheinen multiplex-RT-PCR-testi yhdeksälle, kirjallisuudesta etsitylle, degeneroidulle alukeparille poty-, potex-, tobra- ja tospovirussukujen, tobamoviruksen alaryhmä yhden, nepoviruksen a- ja b-alaryhmien, Bromoviridae-virusheimon ja Tombusviridae-heimoon kuuluvien carmo-, diantho- ja tombusvirussukujen samanaikaiseen tunnistamiseen. Tutkimuksessa käytettiin sekä multiplex-RT-PCR–testejä että siRNA-syväsekvensointia selvittämään viroottisista ja viroottisilta vaikuttaneista näytteistä esiintyvät kasvivirukset. Tunnistamalla kasveissa esiintyvät virukset haluttiin arvioida multiplex-RT-PCR-testien soveltuvuutta useiden eri RNA-virussukuihin kuuluvien virusten tunnistamiseen samalla testillä. siRNA-menetelmää käytettiin multiplex-RT-PCR-testien tulosten oikeellisuuden varmistamiseen. Tutkimuksessa pystyttiin luomaan kaksi multiplex-RT-PCR–testiä, jotka tunnistavat yhteensä kahdeksaan eri virusryhmään kuuluvia viruksia. Saadut tulokset toimivat lähtökohtana multiplex-RT-PCR-testien validoinnille, jonka avulla voidaan varmistua testien antamien tulosten luotettavuudesta ja soveltuvuudesta käyttötarkoitukseensa. Tulokset osoittivat siRNA-syväsekvensoinnin tunnistaneen osasta löytyneistä viruksista lähes niiden koko genomin. Kartoitetuista kasvinäytteistä optimoidut multiplex-RT-PCR-testit havaitsivat lupiinin mosaiikkiviruksen (LuMV) lupiinista (Lupinus polyphyllus Lindl.), arabiksen mosaiikkiviruksen (ArMV) kiinanjaloangervosta (Astilbe chinensis (Maxim.) Franch.) ja kvinoasta (Chenopodium quinoa Willd.), tupakan rattleviruksen (TRV) suikeroalpista (Lysimachia nummularia L.) ja mahdollisesti uuden potyviruslajin valkomesikästä (Melilotus albus Medik.). siRNA-syväsekvensointi tunnisti näytteistä samat kasvivirukset, mikä vahvistaa luottamusta optimoituja multiplex-RT-PCR-testejä kohtaan.Multiplex PCR uses several primer pairs, each specific for different DNA sequences in the same reaction, enabling viruses from different families and genera to be recognized by the same test. The new broad-based method of detecting plant viruses, siRNA analysis, is expected to improve the identification of plant viruses as it does not require a prediction of viruses that may be present in the sample. Due to the method, limiting the test to detecting only certain viruses is unnecessary. The aim of this study was to optimize two or more single-phase multiplex RT-PCR tests for the pest laboratory of the Finnish Food Safety Authority (now known as Finnish Food Authority). The tests were for nine published, degenerate primer pairs for the simultaneous identification of Potyvirus, Potexvirus, Tobravirus and Tospovirus genera, Tobamovirus subgroup 1, Nepovirus subgroups a and b, Bromoviridae family and Carmovirus, Dianthovirus, and Tombusvirus, which belong in the Tombusviridae family. Both multiplex RT-PCR tests and siRNA deep sequencing were used to detect plant viruses from infected samples or samples showing viral symptoms. By identifying the viruses in the plant samples, the goal was to estimate the suitability of multiplex RT-PCR tests for identifying multiple RNA viruses from different genera. siRNA analysis was used to ensure the correctness of the multiplex RT-PCR results. In this study, two multiplex RT-PCR tests were created to detect viruses belonging to eight different virus groups. The obtained results serve as a basis for the validation of the multiplex RT-PCR tests. The validation is required to verify the suitability of the method for its intended use and the reliability of the results of the method. The results showed that siRNA deep sequencing was able to detect almost the whole genome from some of the found viruses. Multiplex RT-PCR tests detected Lupine mosaic virus (LuMV) from lupine (Lupinus polyphyllus Lindl.), Arabic mosaic virus (ArMV) from Chinese astilbe (Astilbe chinensis (Maxim.) Franch.) and from quinoa (Chenopodium quinoa Willd.), Tobacco rattle virus (TRV) from moneywort (Lysimachia nummularia L.) and possibly a new Potyvirus species from honey clover (Melilotus albus Medik.). siRNA analysis detected the same viruses, which increases confidence in the optimized multiplex RT-PCR tests

Multiplex-RT-PCR apuna kasvivirusten laaja-alaisessa tunnistamisessa

Pro gradu -tutkielmassani ”Multiplex-RT-PCR-sovellusten kehittäminen kasvivirusdiagnostiikkaa varten ja virusten tunnistaminen siRNA-analyysillä” optimoin Ruokaviraston kasvintuhoojalaboratoriolle multiplex-RT-PCR-menetelmän ennakkoon valittujen RNA-virusten laaja-alaista tunnistamista varten. Rinnakkaisena menetelmänä käytin siRNA-analyysia varmistaakseni multiplex-RT-PCR:stä saatujen tulosten oikeellisuuden. Tutkimus on havainnollistava osoitus siitä, kuinka kasvivirusten tunnistusmenetelmät kehittyvät jatkuvasti