Formation of stress-specific p53 binding patterns is influenced by chromatin but not by modulation of p53 binding affinity to response elements†

The p53 protein is crucial for adapting programs of gene expression in response to stress. Recently, we revealed that this occurs partly through the formation of stress-specific p53 binding patterns. However, the mechanisms that generate these binding patterns remain largely unknown. It is not established whether the selective binding of p53 is achieved through modulation of its binding affinity to certain response elements (REs) or via a chromatin-dependent mechanism. To shed light on this issue, we used a microsphere assay for protein–DNA binding to measure p53 binding patterns on naked DNA. In parallel, we measured p53 binding patterns within chromatin using chromatin immunoprecipitation and DNase I coupled to ligation-mediated polymerase chain reaction footprinting. Through this experimental approach, we revealed that UVB and Nutlin-3 doses, which lead to different cellular outcomes, induce similar p53 binding patterns on naked DNA. Conversely, the same treatments lead to stress-specific p53 binding patterns on chromatin. We show further that altering chromatin remodeling using an histone acetyltransferase inhibitor reduces p53 binding to REs. Altogether, our results reveal that the formation of p53 binding patterns is not due to the modulation of sequence-specific p53 binding affinity. Rather, we propose that chromatin and chromatin remodeling are required in this process

Mécanismes de régulation du cycle cellulaire, de l'apoptose et de la sénescence par p53 en réponse à une exposition aux UVB ou à la Nutlin-3

Environ 50 % des cancers possèdent une mutation dans l'un des allèles du gène p53. Ce gène code pour une protéine qui a pour rôle de maintenir l'intégrité du génome ainsi que 1' homéostasie cellulaire. Comprendre les mécanismes de régulation qui sous-tendent l'activité transcriptionnelle de p53 est donc d'une importance cruciale pour mieux comprendre la dérégulation que subissent les cellules cancéreuses. Jusqu'à maintenant, deux théories ont été proposées pour expliquer le mode d'action de p53 sur ses gènes effecteurs. La première théorie suggère que p53 subit des modifications posttraductionnelles qui permettent sa liaison uniquement au niveau des gènes qui ont besoin d'être régulés. La deuxième propose que p53 se fixe sur chacun de ses éléments de réponse et que des évènements post-fixation agissent comme des filtres pour permettre la transcription de gènes spécifiques. La majorité des études concernant la fixation de p53 sur ses gènes effecteurs ont été réalisées suite à un seul stress, sur un seul gène effecteur ou au niveau d'un seul des éléments de réponse (ER) de p53 présents sur le gène d'intérêt. Nous avons donc voulu approfondir notre compréhension de la modulation du patron de fixation de p53 sur ses ER en fonction de l'intensité du stress subi par la cellule. Est-ce que ce patron de fixation varie en fonction de l'intensité du stress et du devenir cellulaire? Pour répondre à cette question, nous avons exposé des fibroblastes normaux et des fibroblastes humains Li-Fraumeni immortalisés et mutés pour le gène p53 (LF041) à différentes doses d'UVB et de Nutlin-3, chacune d'elle menant à une fin différente pour la cellule soit l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la sénescence. Suite à ces traitements, nous avons vérifié le niveau d'induction de p53 par immunofluorescence, l'induction de la transcription du gène p21 par RT-PCR ainsi que le patron de fixation de la protéine p53 sur ses ER situés au niveau du promoteur de p21 par LMPCR. Tout d'abord, comme les différentes doses de Nutlin-3 n'ont pas influencé le devenir cellulaire et n'entraînent qu'un arrêt du cycle cellulaire, nous nous questionnons sur l'impact de la présence des modifications post-traductionnelles dans le processus de déclenchement de l'apoptose et de la nécrose. Nous avons aussi montré que la transcription du gène p21 n'est pas proportionnelle avec le niveau de la protéine p53 à l'intérieur des cellules mais est plutôt liée aux réponses de la cellule. Nous avons aussi confirmé la présence de patrons de fixation de p53 sur ses ER du gène p21. Ces patrons ne sont pas modifiés en fonction de la dose reçue mais l'intensité des empreintes est modulée en fonction de la dose du stress reçue et du temps suivant l'exposition. Comme projet futurs, il serait très intéressant de vérifier le patron et l'intensité de fixation de p53 sur des gènes impliqués dans d'autres voies cellulaires comme par exemple Bax et de valider si le même phénomène se produit dans d'autres types cellulaires