Production of zika virus envelope protein domain III in Komagataella phaffii and evaluation in diagnostics and as vaccine candidate

O vírus Zika (ZIKV) representa uma ameaça à saúde humana global, pois pode causar a síndrome congênita do ZIKV e a síndrome de Guillain-Barré, doenças graves que levaram a Organização Mundial da Saúde declarar esse vírus como uma emergência em saúde pública de preocupação internacional em 2016. Ele é um vírus com genoma de RNA fita simples, senso positivo, o qual codifica três proteínas estruturais (C, prM/M e E) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5), as quais são traduzidas durante o ciclo de vida viral. A proteína E está presente no envelope do ZIKV, e o seu domínio III (EDIII) é responsável principalmente pela ligação viral ao receptor na célula-alvo. Ele é descrito como um domínio antigênico e imunogênico, pois gera anticorpos altamente neutralizantes e muito específicos contra o ZIKV. Assim, o EDIII pode ser utilizado tanto para diagnóstico como para vacina. Atualmente não existe vacina disponível contra o ZIKV e os testes de diagnóstico enfrentam problemas de sensibilidade e especificidade, demandando esforços para encontrar novos candidatos para superar essas barreiras. Nesse contexo, o objetivo desse trabalho foi produzir o EDIII de ZIKV em levedura e avaliar o seu potencial para aplicações diagnósticas e desenvolvimento de vacina. Os resultados obtidos nesse trabalho demonstraram que o EDIII foi produzido eficientemente em Komagataella phaffii, e foi reconhecido por anticorpos contra ZIKV no ensaio de ELISA. Quando avaliado o seu potencial imunológico, induziu a produção de anticorpos neutralizantes em camundongos imunizados. O EDIII produzido nesse trabalho tem o potencial para aplicações diagnósticas e desenvolvimento de futuras vacinas contra o ZIKV. Palavras-chave: ZIKV. Komagataella phaffii. EDIII. Diagnóstico. Vacina.Zika virus (ZIKV) represents a threat to global human health because it can cause ZIKV congenital syndrome and Guillain-Barré syndrome, serious diseases that led the World Health Organization to declare this virus as a public health emergency of international concern in 2016. It is a virus with a positive sense single-stranded RNA genome, which encodes three structural proteins (C, prM/M, and E) and seven non- structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, and NS5), which are translated during the viral life cycle. The E protein is present in the ZIKV envelope, and its domain III (EDIII) is mainly responsible for viral binding to the receptor on the target cell. It is described as an antigenic and immunogenic domain, as it generates highly neutralizing and very specific antibodies against ZIKV. Thus, EDIII can be used both for diagnosis and as a vaccine. Currently, there is no vaccine available against ZIKV, and diagnostic tests face problems of sensitivity and specificity, requiring efforts to find new candidates to overcome these barriers. In this context, the objective of this work was to produce ZIKV EDIII in yeast and to evaluate its potential for diagnostic applications and vaccine development. The results obtained in this work demonstrated that EDIII was efficiently produced in Komagataella phaffii and was recognized by antibodies against ZIKV in ELISA. When its immunological potential was evaluated, it induced the production of neutralizing antibodies in immunized mice. The EDIII produced in this work has the potential for diagnostic applications and the development of future vaccines against ZIKV. Keywords: ZIKV. Komagataella phaffii. EDIII. Diagnosis. Vaccine.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Expression of the nonstructural proteins 1 (NS1) of the Dengue-1, Dengue-3 and Dengue-4 viruses in Pichia pastoris

A dengue é uma doença amplamente distribuída pelo mundo, e representa um grande problema de saúde pública em vários países. As manifestações clínicas podem variar desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até um quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque. O diagnóstico na sua fase inicial é muito importante, pois auxilia no tratamento sintomático do paciente e na adoção de medidas para o controle do vetor, prevenindo a dispersão da doença. Nesse contexto, a detecção de antígenos virais, especialmente a proteína não estrutural 1 (NS1), é uma alternativa muito eficaz para realizar o diagnóstico da dengue. Essa proteína é sintetizada pelas células infectadas, podendo ser detectada nos sobrenadantes das culturas ou no soro de pacientes infectados. Dessa forma, ela pode ser utilizada como antígeno para o desenvolvimento de kits de diagnóstico. No entanto, um grande problema no desenvolvimento de tais kits, consiste na obtenção desses antígenos, que geralmente é realizado por métodos caros, trabalhosos e de difícil execução. Nesse contexto, objetivou-se nesse trabalho utilizar um sistema de expressão eucariótico para produzir as proteínas NS1 dos vírus dengue-1, -3 e -4, e avaliar a sua antigenicidade. O gene otimizado da proteína NS1 do vírus dengue-4 foi clonado no plasmídeo pPICZαA, o qual foi utilizado para transformar leveduras Pichia pastoris por eletroporação. Posteriormente,a levedura transformada foi submetida á indução da expressão da proteína NS1. Outras duas leveduras transformadas, de maneira independente, com dois plasmídeos diferentes (pPICZαA/NS1DENV1 e pPICZαA/NS1DENV3) também foram induzidas a expressar as proteínas NS1 dos vírus dengue-1 e dengue-3. Proteínas de 60 kDa (NS1 DENV4), e duas de 50 kDa (NS1 DENV-1 e NS1 DENV-3) foram obtidas. Essas proteínas mostraram-se antigênicas no teste de Western Blot, demonstrando o seu potencial para serem utilizadas como antígenos para aplicações diagnósticas.Dengue is a disease widely distributed throughout the world and represents a major public health problem in several countries. Clinical manifestations may range from a benign non-specific viral syndrome to severe and fatal hemorrhagic shock syndrome. The diagnosis in its initial phase is very important, since it assists in the symptomatic treatment of the patient and in the adoption of measures for the control of the vector, preventing the dispersion of the disease. In this context, detection of viral antigens, especially nonstructural protein 1 (NS1), is a very effective alternative for the diagnosis of dengue. This protein is synthesized by infected cells and can be detected in culture supernatants or in the serum of infected patients. In this way, it can be used as antigen for the development of diagnostic kits. However, a major problem in the development of such kits is the procurement of these antigens, which is usually accomplished by costly, laborious and difficult methods. In this context, the objective of this study was to use a eukaryotic expression system to produce the NS1 proteins of dengue-1, -3 and -4 viruses, and to evaluate their antigenicity. The optimized NS1 protein gene of the dengue-4 virus was cloned into the plasmid pPICZαA, which was used to transform Pichia pastoris yeasts by electroporation. Subsequently, the transformed yeast was subjected to the induction of NS1 protein expression. Two other yeasts independently transformed with two different plasmids (pPICZαA/NS1DENV1 and pPICZαA/ NS1DENV3) were also induced to express the NS1 proteins of the dengue-1 and dengue-3 viruses. Proteins of 60 kDa (NS1 DENV4) and two of 50 kDa (NS1 DENV1 and NS1 DENV3) were obtained. These proteins were shown to be antigenic in the Western Blot test, demonstrating their potential to be used as antigens for diagnostic applications.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Zika Virus Envelope Protein Domain III Produced in <i>K. phaffii</i> Has the Potential for Diagnostic Applications

Zika virus (ZIKV) represents a global human health threat and it is related to severe diseases such as congenital Zika syndrome (CZS) and Guillain-Barré syndrome (GBS). There is no vaccine available nor specific antiviral treatment, so developing sensitive, specific, and low-cost diagnostic tests is necessary. Thus, the objective of this work was to produce the Zika virus envelope protein domain III (ZIKV-EDIII) in Komagataella phaffii KM71H and evaluate its potential for diagnostic applications. After the K. phaffii had been transformed with the pPICZαA-ZIKV-EDIII vector, an SDS-PAGE and Western Blot were performed to characterize the recombinant protein and an ELISA to evaluate the antigenic potential. The results show that ZIKV-EDIII was produced in the expected size, with a good purity grade and yield of 2.58 mg/L. The receiver operating characteristic (ROC) curve showed 90% sensitivity and 87.5% specificity for IgM, and 93.33% sensitivity and 82.76% specificity for IgG. The ZIKV-EDIII protein was efficiently produced in K. phaffi, and it has the potential for diagnostic applications