Selektion potentieller Eisenoxidnanopartikel für die Brustkrebstherapie anhand in vitro Zytotoxizität und intrazellulärer Aufnahme

Hintergrund und Ziele: Brustkrebs ist weltweit die häufigste maligne Tumorerkrankung bei Frauen. Zwar haben sich in den letzten Jahrzehnten auch Diagnostik und Therapiemöglichkeiten weiterentwickelt, doch führen diese immer noch zu erheblichen Einschränkungen sowie Folgeschäden bei Patienten. Besonders Chemotherapeutika haben durch ihre ungezielte Wirkweise starke Nebenwirkungen und verlangen nach neuartigen Therapiekonzepten. Ein Ansatz ist das „Magnetic Drug Targeting (MDT) mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs). Dabei werden Medikamente an magnetische Partikel gebunden und durch Anlegen eines Magnetfeldes in der Zielregion angereichert. Um einen klinischen Einsatz von MDT als Brustkrebstherapie zu ermöglichen ist es wichtig, die Eigenschaften der Nanopartikel und deren Einfluss auf Brustkrebszellen, besonders im Hinblick auf Biokompatibilität und zelluläre Toxizität, zu erforschen. Ziel dieser Arbeit ist es daher die Auswirkungen zahlreicher Faktoren auf unterschiedlichen Brustkrebszelllinien zu untersuchen, wie zum Beispiel die Beschaffenheit der Partikelkorona und die dosisabhängigen zellulären Effekte der SPIONs. Dabei sollen besonders die zelluläre Partikelaufnahme, die Zelltoxizität und der Einfluss auf die Zellproliferation untersucht werden um geeignete Nanopartikel für eine mögliche zukünftige Brustkrebstherapie zu finden. Diese sollten neben einer hohen Biokompatibilität für einen klinischen Einsatz zudem eine geringe Toxizität aufweisen und bevorzugt von den Zielzellen aufgenommen werden. Methoden und Materialien: Zur physikochemischen Charakterisierung der Nanopartikel wurden die magnetischen Eigenschaften, die Oberflächeneigenschaften, der Durchmesser, das Zetapotential und die Stabilität in Wasser, Zellkulturmedium und Blut untersucht. Die Brustkrebszelllinien T-47D (American Type Culture Collection, ATCC HTB-133), BT-474 (ATCC HTB-20), MCF7 (ATCC HTB-22) und MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) wurden mit je drei unterschiedlichen Konzentrationen der mit Laurinsäure beschichteten SPIONs (lauric acid coated SPION, SPIONLA), mit einer Kombination aus Laurinsäure und humanem Serumalbumin beschichteten SPIONs (lauric acid and human albumin coated SPIONs, SPIONLA-HSA) und mit Dextran beschichteten SPIONs, (dextran-coated SPIONs, SPIONDEX) für 24 Stunden, sowie 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden Zellgranularität und Viabilität mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Des Weiteren wurde der zelluläre Eisengehalt mit Hilfe eines Atom-Emissions-Spektrometer (AES) gemessen. Zur Visualisierung der Eisenaufnahme sowie möglichen Veränderungen des Zytoskeletts wurden lichtmikroskopische Aufnahmen der Zellen angefertigt. Ergebnisse und Beobachtungen: Bei der Charakterisierung der Nanopartikel zeigten sich ähnliche Magnetisierungseigenschaften für SPIONLA und SPIONLA-HSA, während SPIONDEX eine vergleichsweise niedrigere Sättigungsmagnetisierung aufwies. Die Messungen bezüglich der Partikelgröße und Sedimentation zeigten eine hohe kolloidale Stabilität für SPIONLA-HSA und SPIONDEX, wohingegen SPIONLA in Zellkulturmedien mit niedrigem Gehalt von fetalem Kälberserum (fetal calf serum, FCS) zur Agglomeration neigte. Interessanterweise war eine Agglomeration in humanem Blut bei keinem Partikelsystem zu beobachten. Es konnte eine dosis-, partikel-, zell- und zeitabhängige Eisenaufnahme festgestellt werden. Bei den AES Messungen wurden die höchste Eisenkonzentrationen in allen Zelllinien bei SPIONLA gemessen, gefolgt von SPIONLA-HSA und zuletzt SPIONDEX. In den mikroskopischen Aufnahmen mit Berliner Blau Färbung konnte die partikelabhängige Eisenaufnahme bestätigt werden. In der Durchflusszytometrie mit Fluoreszenz-markierten Zellen wurde das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSc) als Marker für die Zellgranularität erfasst. Der SSc-Messwert korrelierte dabei ebenso mit der Eisen- und somit auch mit der Partikelaufnahme bei SPIONLA und SPIONLA-HSA. Bei den SPIONDEX konnte aufgrund der insgesamt sehr geringen Eisenaufnahme keine signifikante Korrelation zwischen den sehr sensitiven AES Daten und den SSC-Werten nachgewiesen werden. Weitere durchflusszytometrische Experimente zur Bestimmung der Zellviabilität zeigten eine geringe Toxizität der SPIONs bei den Zelllinien BT-474, T-47D und MCF-7. Die MDA-MB-231 Zellen reagierten jedoch empfindlicher auf die SPIONs. Besonders SPIONLA führte zu einem dosisabhängigen Rückgang der vitalen Zellen auf 63-66%. Die Vitalität der deutlich empfindlicheren Kontrollzellen, humane Epithelzellen aus Nabelschnurvenen (human umibilical vein endothelial cells, HUVECs), war, insbesondere nach Inkubation mit SPIONLA, bis auf 15% vitaler Zellen reduziert. Im Gegensatz dazu hatten SPIONLA-HSA und SPIONDEX keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl apoptotischer oder nekrotischer Zellen. Schlussfolgerungen: In den durchgeführten Experimenten konnten unterschiedliche Auswirkungen der einzelnen Nanopartikel auf die Brustkrebszellen nachgewiesen werden. Entscheidend für die Selektion potentieller Nanopartikel ist, dass jegliche Nanopartikel bei Applikation zuerst mit Endothelzellen in Kontakt kommen, ihre Aufnahme und Wirkung jedoch auf Tumorzellen gerichtet ist. Dies zeigt die Wichtigkeit einer biokompatiblen Oberfläche auf, welche beispielsweise bei SPIONLA-HSA durch eine Hülle aus humanem Serumalbumin gegeben ist. Die durchflusszytometrischen Messungen wiesen geringe toxische Effekte der SPIONLA-HSA und SPIONDEX auf Zellaktivität und -proliferation nach. Im Gegensatz dazu zeigte SPIONLA eine unerwünschte erhöhte Toxizität bei der Inkubation der HUVECs. Neben der stabilisierenden Proteinhülle spielt der Zelltyp eine entscheidende Rolle für die Aufnahme der Partikel. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur zwischen Kontroll- und Brustkrebszellen, sondern auch zwischen den einzelnen Brustkrebszelltypen ein Unterschied in der Eisenaufnahme besteht. Zusätzlich wurde bei der Messung der Partikelaufnahme die Korrelation des SSc der Durchflusszytometrie mit dem Eisengehalt der Brustkrebszellen gezeigt. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass der SSc neben HUVECs und Brustkrebszellen auch für andere Zelltypen als Marker der Partikelaufnahme hergenommen werden kann. Zusammengefasst stellen die Nanopartikel SPIONLA-HSA und SPIONDEX zwei Optionen für weitere Forschung und eventuell zukünftige klinische Anwendungen dar. Um jedoch biokompatible Nanopartikel mit hoher Verträglichkeit und adäquater Zellaufnahme gewährleisten zu können müssen diese durch weitere in vitro sowie in vivo Experimente zusätzlich charakterisiert werden

Selection of potential iron oxide nanoparticles for breast cancer treatment based on in vitro cytotoxicity and cellular uptake

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are promising tools for the treatment of different diseases. Their magnetic properties enable therapies involving magnetic drug targeting (MDT), hyperthermia or imaging. Depending on the intended treatment, specific characteristics of SPIONs are required. While particles used for imaging should circulate for extended periods of time in the vascular system, SPIONs intended for MDT or hyperthermia should be accumulated in the target area to come into close proximity of, or to be incorporated into, specific tumor cells. In this study, we determined the impact of several accurately characterized SPION types varying in size, zeta potential and surface coating on various human breast cancer cell lines and endothelial cells to identify the most suitable particle for future breast cancer therapy. We analyzed cellular SPION uptake, magnetic properties, cell proliferation and toxicity using atomic emission spectroscopy, magnetic susceptometry, flow cytometry and microscopy. The results demonstrated that treatment with dextran-coated SPIONs (SPIONDex) and lauric acid-coated SPIONs (SPIONLA) with an additional protein corona formed by human serum albumin (SPIONLA-HSA) resulted in very moderate particle uptake and low cytotoxicity, whereas SPIONLA had in part much stronger effects on cellular uptake and cellular toxicity. In summary, our data show significant dose-dependent and particle type-related response differences between various breast cancer and endothelial cells, indicating the utility of these particle types for distinct medical applications

Selection of potential iron oxide nanoparticles for breast cancer treatment based on in vitro cytotoxicity and cellular uptake

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are promising tools for the treatment of different diseases. Their magnetic properties enable therapies involving magnetic drug targeting (MDT), hyperthermia or imaging. Depending on the intended treatment, specific characteristics of SPIONs are required. While particles used for imaging should circulate for extended periods of time in the vascular system, SPIONs intended for MDT or hyperthermia should be accumulated in the target area to come into close proximity of, or to be incorporated into, specific tumor cells. In this study, we determined the impact of several accurately characterized SPION types varying in size, zeta potential and surface coating on various human breast cancer cell lines and endothelial cells to identify the most suitable particle for future breast cancer therapy. We analyzed cellular SPION uptake, magnetic properties, cell proliferation and toxicity using atomic emission spectroscopy, magnetic susceptometry, flow cytometry and microscopy. The results demonstrated that treatment with dextran-coated SPIONs (SPIONDex) and lauric acid-coated SPIONs (SPIONLA) with an additional protein corona formed by human serum albumin (SPIONLA-HSA) resulted in very moderate particle uptake and low cytotoxicity, whereas SPIONLA had in part much stronger effects on cellular uptake and cellular toxicity. In summary, our data show significant dose-dependent and particle type-related response differences between various breast cancer and endothelial cells, indicating the utility of these particle types for distinct medical applications