Cardiac Muscarinic Receptor Overexpression in Sudden Infant Death Syndrome

BACKGROUND: Sudden infant death syndrome (SIDS) remains the leading cause of death among infants less than 1 year of age. Disturbed expression of some neurotransmitters and their receptors has been shown in the central nervous system of SIDS victims but no biological abnormality of the peripheral vago-cardiac system has been demonstrated to date. The present study aimed to seek vago-cardiac abnormalities in SIDS victims. The cardiac level of expression of muscarinic receptors, as well as acetylcholinesterase enzyme activity were investigated. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Left ventricular samples and blood samples were obtained from autopsies of SIDS and children deceased from non cardiac causes. Binding experiments performed with [(3)H]NMS, a selective muscarinic ligand, in cardiac membrane preparations showed that the density of cardiac muscarinic receptors was increased as shown by a more than doubled B(max) value in SIDS (n = 9 SIDS versus 8 controls). On average, the erythrocyte acetylcholinesterase enzyme activity was also significantly increased (n = 9 SIDS versus 11 controls). CONCLUSIONS: In the present study, it has been shown for the first time that cardiac muscarinic receptor overexpression is associated with SIDS. The increase of acetylcholinesterase enzyme activity appears as a possible regulatory mechanism

Constitutive Overexpression of Muscarinic Receptors Leads to Vagal Hyperreactivity

BACKGROUND: Alterations in muscarinic receptor expression and acetylcholinesterase (AchE) activity have been observed in tissues from Sudden Infant Death Syndrome (SIDS). Vagal overactivity has been proposed as a possible cause of SIDS as well as of vasovagal syncopes. The aim of the present study was to seek whether muscarinic receptor overexpression may be the underlying mechanism of vagal hyperreactivity. Rabbits with marked vagal pauses following injection of phenylephrine were selected and crossed to obtain a vagal hyperreactive strain. The density of cardiac muscarinic receptors and acetylcholinesterase (AchE) gene expression were assessed. Blood markers of the observed cardiac abnormalities were also sought. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Cardiac muscarinic M(2) and M(3) receptors were overexpressed in hyperreactive rabbits compared to control animals (2.3-fold and 2.5-fold, respectively) and the severity of the phenylephrine-induced bradycardia was correlated with their densities. A similar overexpression of M(2) receptors was observed in peripheral mononuclear white blood cells, suggesting that cardiac M(2) receptor expression can be inferred with high confidence from measurements in blood cells. Sequencing of the coding fragment of the M(2) receptor gene revealed a single nucleotide mutation in 83% of hyperreactive animals, possibly contributing for the transcript overexpression. Significant increases in AchE expression and activity were also assessed (AchE mRNA amplification ratio of 3.6 versus normal rabbits). This phenomenon might represent a compensatory consequence of muscarinic receptors overexpression. Alterations in M(2) receptor and AchE expression occurred between the 5th and the 7th week of age, a critical period also characterized by a higher mortality rate of hyperreactive rabbits (52% in H rabbits versus 13% in normal rabbits) and preceeded the appearance of functional disorders. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: The results suggest that cardiac muscarinic receptor overexpression plays a critical role in the development of vagal hyperreactivity, whereas AchE hyperactivity appears as a compensatory consequence of it. Since similar vagal disorders were observed recently by us in SIDS, muscarinic receptor overexpression could become a marker of risk of vasovagal syncopes and SIDS

Recepteurs muscariniques de l'acetylocholine : caracterisation de la liaison des agonistes et des antagonistes

SIGLECNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Les métallothionéines dans la régulation du stress oxydant (application à la maladie d'Alzheimer)

STRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF

Cancer et inflamation (rôle des mastocytes)

STRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF

Rôle des mastocytes dans le développement des astrocytomes humains (implication du récepteur CD47)

Des études suggèrent que les cellules inflammatoires joueraient un rôle initiateur du cancer et contribueraient activement à son développement. Mes travaux se focalisent sur l étude des gliomes humains et les mastocytes. Les gliomes sont les tumeurs les plus fréquentes du SNC. Les mastocytes constituent des cellules d intérêt dans l étude du microenvironnement inflammatoire des tumeurs. Grâce à une technique de coculture mastocytes/astrocytomes nous avons montré que les mastocytes induisent la prolifération des astrocytomes humains et n ont pas d effet sur les astrocytes. Cet effet prolifératif nécessite un contact direct entre les deux types cellulaires (ce qui suggère l implication de molécules d adhérence) et est dépendant de la sécrétion de l IL6. Aussi avons-nous ciblé le couple CD47/SIRPa et le couple CD40/CD40L qui sont impliqués dans le contrôle de la balance prolifération/apoptose ou/et la sécrétion de médiateurs de l inflammation. L activation du récepteur CD47 dans les astrocytomes humains favorise leur prolifération. La voie de signalisation intracellulaire implique le dimère bg des protéines G, une activation consécutive de la voie PI3K/Akt, une surexpression de la protéine UHRF1 accompagnée d une diminution de l expression du GST p16INK4A. Il semblerait également que l activation du récepteur CD47 induise une translocation de NF- B et l expression de gènes de cytokines en particulier l IL-6 qui contribuerait à la prolifération des astrocytomes. Cette voie de signalisation n est pas activée dans les astrocytes. En coculture l augmentation de la prolifération des astrocytomes est accompagnée d une diminution de l expression de CD47 et son ligand SIRPa. Ces effets sont accompagnés par une phosphorylation d Akt et ERK. Nous avons également montré que l activation du récepteur CD40 favorise la prolifération des astrocytomes via la voie de l IL6.Studies suggest that inflammatory cells play an initiating role of cancer and would contribute actively to its development. My work focused on the study of human glioma and mast cells. Gliomas are the most frequent tumors of the central nervous system (CNS). Mast cells are cells of interest in the study of Tumor inflammatory Microenvironment. Using the technique of coculture: mast cells/astrocytomas we have shown that mast cells induce the proliferation of human astrocytomas and have no effect on astrocytes. The proliferative effect requires a direct contact between the two cell types (which suggests the involvement of adhesion molecules) and is dependent on the secretion of the IL6. We also targeted the CD47/SIRPa and CD40/CD40L interactions who are involved in the control of the proliferation/apoptosis balance or / and the secretion of mediators of inflammation. Activation of the CD47 receptor in human astrocytomas enhances their proliferation. Intracellular signaling pathway involves the bg dimer of G-protein and consecutive activation of the PI3K/Akt Pathway. Activation of CD47 induces overexpression of the UHRF1 protein, this increase of UHRF1 accompanied by a decrease in the expression of the tumor suppressor gene (p16INK4A). It would also appear that CD47 receptor activation induces a translocation of NF - B and the expression of genes of cytokines particularly IL-6 which would contribute to the proliferation of astrocytomas. This signalling pathway is not enabled in astrocytes. In coculture, the proliferation of astrocytomas is accompanied by a decrease in CD47 expression and its ligand SIRPa. These effects are accompanied by a phosphorylation of Akt and ERK. We have also shown that activation of CD40 receptor promotes the proliferation of astrocytomas via the IL-6 dependent pathway.STRASBOURG-Bib.electronique 063 (674829902) / SudocSudocFranceF

Récepteurs des cellules microgliales impliqués dans la reconnaissance et l'ingestion des peptides amyloïdes

La maladie d'Alzheimer est une démence neurodégénérative qui se manifeste par des troubles de la mémoire et par une perte du contrôle émotionnel et des capacités intellectuelles. La maladie se caractérise par 2 types de lésions dans le cerveau: (a) des lésions intracellulaires que l'on appelle les dégénérescences neurofibrillaires; (b) des lésions extracellulaires que l'on appelle les plaques séniles. Ces plaques sont formées par un peptide de 39 à 43 aminoacides appelé protéine bêta amyloïde ou Ab.Les cellules microgliales représentent les macrophages du système nerveux central. Elles remplissent les fonctions de phagocytose. Le peptide Ab peut activer les cellules microgliales. Par ailleurs ces cellules peuvent éliminer le peptide du milieu de culture.Nous nous proposons d'étudier les mécanismes moléculaires d'élimination des fibres de peptide Ab par les cellules microgliales, et d'identifier les récepteurs impliqués dans la phagocytose et la signalisation intracellulaire associée à l'ingestion.Notre modèle d'étude vise à construire des plaques séniles artificielles obtenues par la fixation de peptide amyloïde à la surface de levures. Saccharomyces cerevisiae) autoclavées [LA]. Selon la nature du peptide [Ab 1-40 ou Ab 1-42] qui recouvre les LA on leur donne le nom de LA 1-40 et LA 1-42. Nous utilisons une coloration au MGG afin d'identifier et quantifier les levures phagocytées et adhérentes. En utlisant ce modèle d'étude nous avons pu montrer que les récepteurs LRP et CR3 sont impliqués dans la phagocytose des LA 1-40 et LA 1-42. Nous avons aussi montré que les HSPG sont important pour la phagocytose et que les ions calcium et magnésium sont surtout impliqué dans la reconnaissance et l'ingestion des LA 1-42 mais aussi les LA 1-40. Nous avons étudié la signalisation intracellulaire associée à la phagocytose, nous avons montré que la PKA, les PKC et la PI3-kinase sont impliqués dans cette signalisation.Amyloid peptides 1-40 and 1-42 (Ab 1-40 and Ab 1-42) are major components of diffuse and neuritic senile plaques present in the brain of patients with Alzheimer's disease. Their interaction with microglial cells was studied using a system partly mimicking these plaques, which consisted in heat-killed yeast particles coated with either Ab 1-40 and Ab 1-42. Using these particles we show that LRP and CR3 receptors are involved mainly in the elimination of Ab 1-42-coated heat-killed yeast particles and partly in that of Ab 1-40-coated heat-killed yeast particles by microglial cells in culture. We also show that in the presence of extracellular calcium and magnesium ions chelators, internalization of coated heat-killed particles was impaired. In the presence of BAPTA-AM, an intracellular chelator of calcium ions and thapsigargin an inhibitor of the endoplasmic reticulum calcium pump, no effect was observed on the phagocytosis of Ab 1-40-coated heat-killed yeast particles whereas that of Ab 1-42- coated heat-killed yeast particles was affected These results suggest that different signaling mechanisms are involved after the internalization of Ab 1-40 and Ab 1-42. Using different inhibitors we show that PKA, PKC and PI3-kinase are implicated in phagocytosis intracellular signalling. Cytotoxicity tests show that heat-killed yeast particles coated with either Ab 1-40 and Ab 1-42 are not toxic to microglial cells and are digested by these cells after internalisation.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de la perte précoce des îlots pancréatiques au cours de la transplantation

De l isolement des îlots pancréatiques à leur implantation, l inflammation est omniprésente au cours de la transplantation d îlots pancréatiques. Le maintien d une inflammation contrôlée est essentiel pour préserver la survie et la fonctionnalité du greffon à court et long terme. L objectif de ce travail de thèse est d identifier précisément les mécanismes inflammatoires à l origine de la perte précoce des îlots et de déterminer des cibles thérapeutiques pour limiter ces réactions inflammatoires.Nous avons ainsi démontré que les conditions de culture induisent des réactions à l origine du développement d un phénotype pro-inflammatoire et pro-oxydant propre à l îlot. Cette induction se caractérise par une élévation de la sécrétion de cytokines, de chimiokines pro-inflammatoires, une activation des voies de l inflammation Toll-like récepteurs (TLRs)-dépendantes et une génération d espèces réactives de l oxygène (ROS). Toutefois, ce processus peut être prévenu par l activation de l Hème oxygénase-1 (HO-1), une enzyme anti-oxydante et anti-inflammatoire.Par l étude des réactions inflammatoires sur un modèle animal de transplantation mimant les conditions de transplantation humaine, nous avons démontré qu un changement des médiateurs plasmatiques de l inflammation et du protéome hépatique s opère 12 heures après transplantation. De plus, ces résultats sont associés à une infiltration des îlots par les cellules immunitaires qui s organise 12 heures après transplantation. Nous avons également établi le rôle anti-inflammatoire de la rapamycine (une drogue immunomodulatrice) sur les îlots et les macrophages in vitro. Nous avons ainsi démontré que l usage de la rapamycine avec la mise en place d un pré-traitement des îlots et du receveur avant la greffe serait envisageable. Ces travaux ont permis de caractériser les mécanismes inflammatoires mis en oeuvre immédiatement avant et après transplantation. Ainsi, ces données offrent de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles de prévenir et/ou limiter l inflammation au cours de la transplantation d îlots pancréatiques.From isolation of pancreatic islets to their implantation, the inflammation is ubiquitous in the pancreatic islet transplantation. Maintaining a controlled inflammation is essential to preserve the survival of the graft and the functionality in the short and long term. The objective of this work is to identify precisely the inflammatory mechanisms behind the early loss of islets and identify therapeutic targets to reduce these inflammatory reactions. We have demonstrated that culture conditions induce reactions causing the development of a specific proinflammatory and pro-oxydant phenotype islet. This induction is characterized by an increase in the secretion of cytokines, chemokines pro-inflammatory activation pathways of inflammation Toll-like receptors (TLRs) -dependent and generation of reactive oxygen species (ROS). However, this process can be prevented by the activation of Heme oxygenase-1 (HO-1), an antioxidant and anti-inflammatory enzyme.By studying the inflammatory responses in an animal model of transplantation mimicking the conditions of human transplantation, we demonstrated that a change of plasma mediators of inflammation and liver proteome occurs 12 hours after transplantation. Furthermore, these results are associated with infiltration of the islets by immune cells which organizes 12 hours after transplantation. We also determined the anti-inflammatory role of rapamycin (an immunomodulatory drug) on the islets and macrophages in vitro. We have thus demonstrated that the use of rapamycin with the establishment of a pre-treatment of islets and recipient before transplantation could be considered. These studies have characterized the inflammatory mechanisms implemented immediately before and after transplantation. Thus, these data provide new therapeutic approaches that can prevent and / or reduce inflammation during pancreatic islet transplantationSTRASBOURG-Bib.electronique 063 (674829902) / SudocSudocFranceF

Vers une thérapie génique des amyotrophies spinales progressives (Expression de la protéine SMN dans des cellules musculaires malades)

Introduction :Les amyotrophies spinales infantiles ou SMA pour spinal muscular atrophy sont des maladies neuromusculaires à transmission autosomique récessive caractérisées par une dégénérescence des motoneurones. On distingue 3 formes (SMA de type I, II ou III) classées selon la gravité de la maladie. La forme SMA I est la plus grave. Le gène responsable de la maladie est le gène SMN pour survival motor neuron, muté chez plus de 98 % des patients. Les modèles animaux de cette maladie ne sont disponibles que depuis 2000, donc nous utilisons au laboratoire un modèle d'étude in vitro constitué de cocultures hétérologues nerf-muscle. Lorsque cette structure est réalisée avec des cellules musculaires provenant de patients SMA I ou II (mais non SMA III), elle dégénère au bout de 3 semaines, alors qu'elle se maintient plus d'un an si les cellules satellites sont saines.Hypothèse : Ces observations nous ont amenés à émettre l'hypothèse d'une implication musculaire dans la pathogénie de la maladie. La dégénérescence étant due à une mutation du gène SMN, nous avons envisagé d'introduire la forme normale du gène dans des cellules malades et de suivre le comportement des cocultures suite à un tel traitement.Outils utilisés : La première étape a consisté à construire le plasmide pEGFP-C3/SMN porteur du gène SMN, cloné dans un système d'expression eucaryote Nous avons ensuite comparé différents vecteurs synthétiques de transfection afin de trouver le plus efficace mais le moins toxique pour des cellules musculaires humaines primaires. Celles-ci une fois transfectées au moyen de cet agent ont été sélectionnés au moyen du G418, puis après fusion, les myotubes résultant ont été innervés afin d'observer le comportement des cocultures.Résultats :Le plasmide pEGFP-C3/SMN a été validé par microscopie de fluorescence et confocale. Il a été utilisé pour transfecter les myoblastes humains primaires grâce au FuGENE, l'agent qui s'est révélé être le plus efficace et le moins toxique par rapport à l'Effectene et à l'ExGen 500. Après sélection des cellules transfectées, fusion et innervation, les cocultures réalisées à partir de cellules musculaires issues de patients SMA I transfectées par pEGFP-C3/SMN ne dégénèrent pas, et se comportent comme des cocultures témoins. Ce fait est confirmé par des dosages à l'annexine V des microparticules apoptotiques relarguées par les cocultures. Si le plasmide utilisé est le pEGFP-C3 seul, les cocultures se comportent comme des cocultures malades.Un autre aspect de ce sujet a consisté à étudier l'installation de la jonction neuromusculaire chez les cellules musculaires malades, et plus particulièrement les étapes les plus précoces de ce phénomène. En effet, nous avions observé un défaut dans la fusion des cellules musculaires ainsi que dans l'agrégation des récepteurs de l'acétylcholine chez les patients SMA I. Par des expériences de liaison spécifique, nous avons mis en évidence un déficit d'expression des récepteurs de l'acétylcholine plus de dix fois moindre dans les myotubes résultant de la fusion de cellules musculaires issues de SMA I par rapport aux myotubes témoin. Cette étude a été réalisée en l'absence de tout composant nerveux.Conclusion :Cette étude prouve d'abord que la SMA n'est pas uniquement une maladie du motoneurone, comme ce qui était admis depuis très longtemps, mais que le muscle joue un rôle très important dans la pathogénie. Et surtout, nous ouvrons la voie à de très nombreuses perspectives thérapeutiques à visée musculaire, ce tissu étant beaucoup plus accessible que le système nerveux.Spinal muscular atrophies are neuromuscular disorders with recessive autosomal transmission, characterized by a degeneration of the motoneurons. There are classified in three forms (SMA I, II or III) based on the severity of the symptoms. The SMA I form is the most severe one. The survival of motor neuron [SMN] is known to be responsible for the disease. It is mutated in 98 % of the patients. Animal models are available only since 2000, so we use in our laboratory a model of heterogenous nerve-muscle cocultures. When this structure is realized with muscle cells coming from SMA I or II patients (but not from SMA III), it degenerates after 3 weeks, whereas it can survive beyond one year when the muscle cells are from healthy origin.Based on these observations, we have emitted the hypothesis of a muscle implication in the SMA pathogenesis. The degeneration of the cocultures is due to a mutation in the SMN gene, so we considered the transfection of the normal form of the gene in SMA cells as a possible therapeutic strategy [...]STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Complement receptor 3 (CD11b/CD18) is implicated in the elimination of β-amyloid peptides

Microglia are the professional phagocytes of the brain and express phagocytic receptors such as complement receptor 3 (CR3 or CD11b/CD18). Using mimics of the amyloid deposit made of heat-killed yeasts coated with either Aβ 1-40 or Aβ 1-42, we were able to study how microglia interacted with and ingested these particles in vitro. We have shown previously that the low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) is largely implied in the phagocytosis of Aβ 1-42-opsonized heat-killed yeasts and partly in that of Aβ 1-40-opsonized heat-killed yeasts. Here, we report that antibodies against CD11b or CD18 reduced the uptake of the artificial amyloid deposit by microglial cell showing that CR3 is involved in the mechanism. Moreover, a concomitant inhibition of LRP and CR3 completely blocked the ingestion of both kinds of particles suggesting that no other receptors participate to this mechanism. © 2010 The Authors Fundamental and Clinical Pharmacology © 2010 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique