Vers une thérapie génique des amyotrophies spinales progressives (Expression de la protéine SMN dans des cellules musculaires malades)

Abstract

Introduction :Les amyotrophies spinales infantiles ou SMA pour spinal muscular atrophy sont des maladies neuromusculaires à transmission autosomique récessive caractérisées par une dégénérescence des motoneurones. On distingue 3 formes (SMA de type I, II ou III) classées selon la gravité de la maladie. La forme SMA I est la plus grave. Le gène responsable de la maladie est le gène SMN pour survival motor neuron, muté chez plus de 98 % des patients. Les modèles animaux de cette maladie ne sont disponibles que depuis 2000, donc nous utilisons au laboratoire un modèle d'étude in vitro constitué de cocultures hétérologues nerf-muscle. Lorsque cette structure est réalisée avec des cellules musculaires provenant de patients SMA I ou II (mais non SMA III), elle dégénère au bout de 3 semaines, alors qu'elle se maintient plus d'un an si les cellules satellites sont saines.Hypothèse : Ces observations nous ont amenés à émettre l'hypothèse d'une implication musculaire dans la pathogénie de la maladie. La dégénérescence étant due à une mutation du gène SMN, nous avons envisagé d'introduire la forme normale du gène dans des cellules malades et de suivre le comportement des cocultures suite à un tel traitement.Outils utilisés : La première étape a consisté à construire le plasmide pEGFP-C3/SMN porteur du gène SMN, cloné dans un système d'expression eucaryote Nous avons ensuite comparé différents vecteurs synthétiques de transfection afin de trouver le plus efficace mais le moins toxique pour des cellules musculaires humaines primaires. Celles-ci une fois transfectées au moyen de cet agent ont été sélectionnés au moyen du G418, puis après fusion, les myotubes résultant ont été innervés afin d'observer le comportement des cocultures.Résultats :Le plasmide pEGFP-C3/SMN a été validé par microscopie de fluorescence et confocale. Il a été utilisé pour transfecter les myoblastes humains primaires grâce au FuGENE, l'agent qui s'est révélé être le plus efficace et le moins toxique par rapport à l'Effectene et à l'ExGen 500. Après sélection des cellules transfectées, fusion et innervation, les cocultures réalisées à partir de cellules musculaires issues de patients SMA I transfectées par pEGFP-C3/SMN ne dégénèrent pas, et se comportent comme des cocultures témoins. Ce fait est confirmé par des dosages à l'annexine V des microparticules apoptotiques relarguées par les cocultures. Si le plasmide utilisé est le pEGFP-C3 seul, les cocultures se comportent comme des cocultures malades.Un autre aspect de ce sujet a consisté à étudier l'installation de la jonction neuromusculaire chez les cellules musculaires malades, et plus particulièrement les étapes les plus précoces de ce phénomène. En effet, nous avions observé un défaut dans la fusion des cellules musculaires ainsi que dans l'agrégation des récepteurs de l'acétylcholine chez les patients SMA I. Par des expériences de liaison spécifique, nous avons mis en évidence un déficit d'expression des récepteurs de l'acétylcholine plus de dix fois moindre dans les myotubes résultant de la fusion de cellules musculaires issues de SMA I par rapport aux myotubes témoin. Cette étude a été réalisée en l'absence de tout composant nerveux.Conclusion :Cette étude prouve d'abord que la SMA n'est pas uniquement une maladie du motoneurone, comme ce qui était admis depuis très longtemps, mais que le muscle joue un rôle très important dans la pathogénie. Et surtout, nous ouvrons la voie à de très nombreuses perspectives thérapeutiques à visée musculaire, ce tissu étant beaucoup plus accessible que le système nerveux.Spinal muscular atrophies are neuromuscular disorders with recessive autosomal transmission, characterized by a degeneration of the motoneurons. There are classified in three forms (SMA I, II or III) based on the severity of the symptoms. The SMA I form is the most severe one. The survival of motor neuron [SMN] is known to be responsible for the disease. It is mutated in 98 % of the patients. Animal models are available only since 2000, so we use in our laboratory a model of heterogenous nerve-muscle cocultures. When this structure is realized with muscle cells coming from SMA I or II patients (but not from SMA III), it degenerates after 3 weeks, whereas it can survive beyond one year when the muscle cells are from healthy origin.Based on these observations, we have emitted the hypothesis of a muscle implication in the SMA pathogenesis. The degeneration of the cocultures is due to a mutation in the SMN gene, so we considered the transfection of the normal form of the gene in SMA cells as a possible therapeutic strategy [...]STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF