Investigation of the YY1 interaction with specific and non-specific DNA sequence: comparative study

YY1 jest czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w hamowanie i aktywację ekspresji wielu genów. Białko YY1 zawiera dwie domeny – DBD (DNA-binding domain, reszty aminokwasowe od 295 do 414) oraz NTF (N-terminal fragment, reszty 1-294). Domena DBD posiada cztery motywy palców cynkowych, które biorą udział w wiązaniu białka do DNA oraz innych białek.Poniższa praca ma na celu wykorzystanie jednotryptofanowych mutantów do badania oddziaływania palców cynkowych z DNA, w szczególności użycie ich do zbadania oddziaływania wspomnianego białka ze specyficznie rozpoznawanymi sekwencjami DNA oraz sekwencjami niespecyficznymi.YY1 is a transcription factor involved in the repression and promotion of many genes. YY1 protein contains two domains – DBD (DNA-binding domain, residues from 295 to 414) and NTF (N-terminal fragment, residues 1-294). DBD domain has four zinc finger structural motifs which interact with DNA and other proteins.This paper aims to use single residue substitution with tryptophan to study the interaction between zinc fingers and DNA. Specifically, this model should be used to investigate the difference between the specific and non-specific interaction of YY1 with DNA

Molekularna charakterystyka patogennych wariantów syntazy pseudourydyny 3 (PUS3)

Transferowy RNA (tRNA), kluczowy składnik translacji, wymaga wielu potranskrypcyjnych modyfikacji by prawidłowo pełnić swoją funkcję. Pseudourydylacja jest najczęstszą modyfikacją RNA, a wszystkie tRNA posiadają liczne miejsca pseudourydylacji. Syntazy pseudourydynowe (PUS) są odpowiedzialne za tę modyfikację, zaś PUS3 specyficznie katalizuje reakcję w pozycjach U38 i U39 . Ostatnio kilka badań powiązało mutacje genu PUS3 z zaburzeniami intelektualnymi, jednakże mechanizm tego, jak mutacje wpływają na aktywność enzymu, nie został jeszcze zbadany. W pracy zaprojektowałem dwa uzupełniające się podejścia, aby zrozumieć wpływ mutacji na funkcję białka. Po pierwsze, uzyskałem białka PUS3, w tym białko typu dzikiego i 8 wariantów z różnymi mutacjami przy użyciu owadziego systemu ekspresji. Badania biochemiczne, przy użyciu termoforezy mikroskalowej, testów enzymatycznych, nanoDSF oraz DLS, ujawniły, że niektóre mutacje wpływają na wiązanie tRNA, aktywność pseudourdylacji lub stabilność białka. Po drugie, zastosowałem system transpozycji Sleeping Beauty do wygenerowania stabilnych linii komórkowych z ekspresją tych wariantów PUS3. Następnie zmierzyłem poziomy białek za pomocą metody Western Blot i poziomy kodujących je transkryptów metodą qPCR. Mutanty, które wykazywały zmniejszoną termostabilność wykazują zmniejszony poziom białka w komórkach. Podsumowując, moje wyniki prezentują kompleksową analizę patogennych wariantów PUS3 i wyjaśniają nieprawidłowe działanie białka w chorobie.Transfer RNA (tRNA), a key component in translation, requires multiple posttranscriptional modifications for its proper function. Pseudouridine is the most common RNA modification, and all tRNAs have numerous pseudouridine sites. Pseudouridine synthases (PUS) are responsible for pseudourydilation and PUS3 specifically catalyses the reaction at positions U38 and U39 of tRNAs. Recently, several studies have connected PUS3 mutations to intellectual disorders but the underlying mechanism of how the mutations affect enzyme activity still needs to be investigated.In this study, I designed two complementary approaches to understand the impacts of patient-derived mutations on protein function. First, I produced and purified PUS3 proteins, including wild-type and 8 variants using an insect cell expression system. A plethora of biochemical analyses, including microscale thermophoresis, enzymatic activity assays, nanoDSF and DLS, revealed that the mutations affect tRNA binding, pseudouridylation activity or protein stability. Second, I employed the Sleeping Beauty transposition system to generate stable human cell lines expressing these PUS3 variants. I measured the protein expression levels using Western Blot, as transcripts level using qPCR. In fact, those mutants, which exhibited decreased thermostability show reduced protein expression in human cells. Overall, these results present a comprehensive analysis of pathogenic PUS3 variants and explain the protein malfunction in the related disease

Microwaved-Assisted Synthesis of Starch-Based Biopolymer Membranes for Novel Green Electrochemical Energy Storage Devices

The investigated starch biopolymer membrane was found to be a sustainable alternative to currently reported and used separators due to its properties, which were evaluated using physicochemical characterization. The molecular dynamics of the biomembrane were analyzed using low-field nuclear magnetic resonance (LF NMR) as well as Raman and infrared spectroscopy, which proved that the chemical composition of the obtained membrane did not degrade during microwave-assisted polymerization. Easily and cheaply prepared through microwave-assisted polymerization, the starch membrane was successfully used as a biodegradable membrane separating the positive and negative electrodes in electric double-layer capacitors (EDLCs). The obtained results for the electrochemical characterization via cyclic voltammetry (CV), galvanostatic charge with potential limitation (GCPL), and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) show a capacitance of 30 F g−1 and a resistance of 2 Ohms; moreover, the longevity of the EDLC during electrochemical floating exceeded more than 200 h or a cyclic ability of 50,000 cycles. Furthermore, due to the flexibility of the membrane, it can be easily used in novel, flexible energy storage systems. This proves that this novel biomembrane can be a significant step toward ecologically friendly energy storage devices and could be considered a cheaper alternative to currently used materials, which cannot easily biodegrade over time in comparison to biopolymers

Destabilization of mutated human PUS3 protein causes intellectual disability

Pseudouridine (Ψ) is an RNA base modification ubiquitously found in many types of RNAs. In humans, the isomerization of uridine is catalyzed by different stand-alone pseudouridine synthases (PUS). Genomic mutations in the human pseudouridine synthase 3 gene (PUS3) have been identified in patients with neurodevelopmental disorders. However, the underlying molecular mechanisms that cause the disease phenotypes remain elusive. Here, we utilize exome sequencing to identify genomic variants that lead to a homozygous amino acid substitution (p.[(Tyr71Cys)];[(Tyr71Cys)]) in human PUS3 of two affected individuals and a compound heterozygous substitution (p.[(Tyr71Cys)];[(Ile299Thr)]) in a third patient. We obtain wild-type and mutated full-length human recombinant PUS3 proteins and characterize the enzymatic activity in vitro. Unexpectedly, we find that the p.Tyr71Cys substitution neither affect tRNA binding nor pseudouridylation activity in vitro, but strongly impair the thermostability profile of PUS3, while the p.Ile299Thr mutation causes protein aggregation. Concomitantly, we observe that the PUS3 protein levels as well as the level of PUS3-dependent Ψ levels are strongly reduced in fibroblasts derived from all three patients. In summary, our results directly illustrate the link between the identified PUS3 variants and reduced Ψ levels in the patient cells, providing a molecular explanation for the observed clinical phenotypes