Generation of miR-15a/16-1 cluster-deficient human induced pluripotent stem cell line (DMBi001-A-2) using CRISPR/Cas9 gene editing

miR-15a/16-1 cluster, composed of MIR15A and MIR16-1 genes located in close proximity on chromosome 13 was described to regulate post-natal cell cycle withdrawal of cardiomyocytes in mice. In humans, on the other hand, the level of miR-15a-5p and miR-16-p was negatively associated with the severity of cardiac hypertrophy. Therefore, to better understand the role of these microRNAs in human cardiomyocytes in regard to their proliferative potential and hypertrophic growth, we generated hiPSC line with complete deletion of miR-15a/16-1 cluster using CRISPR/Cas9 gene editing. Obtained cells demonstrate expression of pluripotency markers, differentiation capacity into all three germ layers and normal karyotype

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, in contrast to adipose tissue-derived stromal cells, efficiently improve heart function in murine model of myocardial infarction

Cell therapies are extensively tested to restore heart function after myocardial infarction (MI). Survival of any cell type after intracardiac administration, however, may be limited due to unfavorable conditions of damaged tissue. Therefore, the aim of this study was to evaluate the therapeutic effect of adipose-derived stromal cells (ADSCs) and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) overexpressing either the proangiogenic SDF-1α or anti-inflammatory heme oxygenase-1 (HO-1) in a murine model of MI. ADSCs and hiPSCs were transduced with lentiviral vectors encoding luciferase (Luc), GFP and either HO-1 or SDF-1α. hiPSCs were then differentiated to hiPSC-CMs using small molecules modulating the WNT pathway. Genetically modified ADSCs were firstly administered via intracardiac injection after MI induction in Nude mice. Next, ADSCs-Luc-GFP and genetically modified hiPSC-CMs were injected into the hearts of the more receptive NOD/SCID strain to compare the therapeutic effect of both cell types. Ultrasonography, performed on days 7, 14, 28 and 42, revealed a significant decrease of left ventricular ejection fraction (LVEF) in all MI-induced groups. No improvement of LVEF was observed in ADSC-treated Nude and NOD/SCID mice. In contrast, administration of hiPSC-CMs resulted in a substantial increase of LVEF, occurring between 28 and 42 days after MI, and decreased fibrosis, regardless of genetic modification. Importantly, bioluminescence analysis, as well as immunofluorescent staining, confirmed the presence of hiPSC-CMs in murine tissue. Interestingly, the luminescence signal was strongest in hearts treated with hiPSC-CMs overexpressing HO-1. Performed experiments demonstrate that hiPSC-CMs, unlike ADSCs, are effective in improving heart function after MI. Additionally, long-term evaluation of heart function seems to be crucial for proper assessment of the effect of cell administration

Mechanizm obniżenia poziomu Oksygenazy Hemowej-1 przez kwas walproinowy w przypadku mięsaka prążkowanokomórkowego

Mięsak prążkowanokomórkowy (rhabdomyosarcoma – RMS) jest jednym z najczęstszych mięsaków tkanek miękkich wieku dziecięcego. Można wyróżnić dwa główne typy RMS: embrionalny (embryonal – eRMS) oraz pęcherzykowy (alveolar – aRMS). aRMS cechuje się większą agresywnością oraz potencjałem przerzutowania co spowodowane jest rozregulowaniem szlaku Pax3/7, powodującym zaburzenia ekspresji czynników miogennych. Ostatnie doświadczenia wykazały, że poziom oksygenazy hemowej-1 (HO-1), enzymu cytoprotekcyjnego, jest podniesiony w RMS, co prowadzi do zahamowania różnicowania mięśniowego poprzez zwiększenie aktywności deacetylazy histonowej-4 (HDAC4). Deacetylazyhistonowe są również hamowane przez kwas walproinowy (valproic acid – VA), który jest stosowany w leczeniu padaczki. Celem prezentowanej pracy było zbadanie wpływu VA na ekspresję HO-1.Wykazaliśmy, że ekspresja HO-1 jest wyższa w linii aRMS (CW9019) niż linii eRMS (SMS-CTR). W obu liniach VA obniża poziom HO-1 na poziomie białka, lecz nie na poziomie mRNA. Spośród głównych czynników regulujących HO-1, Nrf2 pozostaje bez zmian, podczas gdy poziom Bach1 wzrasta w odpowiedzi na VA. Jednocześnie obniża się poziom miRNA, które potencjalnie mogą wiązać się do 3'UTR HO-1. Sugeruje to efekt kompensacyjny, gdyż wykazaliśmy, że główny mechanizm obniżania HO-1 przez VA polega prawdopodobnie na zmianie stabilności białka zależnej od poliubikwitynacji. Sugerują to doświadczenia z inhibitorem degradacji proteasomalnej MG132, który odwraca efekt VA na HO-1, oraz wyniki koimmunoprecypitacji, wskazującej na zwiększony poziom ubikwitynowanej HO-1. Skuteczność obniżania HO-1 przez VA została potwierdzona również in vivo w mięśniach myszy. Podawanie VA prowadziło także do spowolnienia wzrostu guzów RMS u myszy po podskórnym wszczepieniu komórek nowotoworowych.Podsumowując, przypuszczamy że VA obniża poziom białka HO-1 poprzez nasilenie degradacji proteasomalnej. Hamujący wpływ VA na wzrost RMS wskazuje, iż związek ten może być przydatny w terapii mięsaka prążkowanokomórkowego.Rhabdomyosarcoma (RMS) is one of the most common forms of soft tissue sarcomas in children. Two main types of RMS are distinguished – embryonal (eRMS) and alveolar (aRMS) RMS. aRMS is characterized by a higher metastatic potential and malignancy, due to deregulation of Pax3/7-dependent pathways followed by improper action of downstream elements governing myogenesis. Recent study showed that heme oxygenase-1 (HO-1), an antioxidative enzyme, is upregulated in RMS, whereit inhibits myogenic differentiation acting through upregulation of histone deacethylase-4 (HDAC4).HDACs are inhibited also by valproic acid (VA), the anti-epileptic drug. The aim of this study was to analyze effect of VA on expression of HO-1.We demonstrated that HO-1 expression is significantly higher in the more aggressive aRMS subtype than in eRMS cells. In both cell types VAdecreased the expression of HO-1 at protein but not at mRNA level. Among the major regulators of HO-1, Nrf2 transcription factor was not changed while its repressor Bach1 was upregulated in response to VA. On the other hand miRNAs predicted to target HO-1 were downregulated. This may suggest a compensatory effect, as we have shown that main mechanism of VA action on HO-1 relies on changes in the protein stability dependent on poliubiquitination. Such supposition was driven from experiments with MG132, inhibitor of proteasomal degradation, which reversed effect of VA on HO-1 expression. Moreover, co-immunoprecipitation assay showed a higher level of ubiquitinated HO-1 after VA treatment. Efficacy of VA in HO-1 downregulation was also confirmed in vivo in murine skeletal muscle. Moreover, local delivery of VA resulted in reduced growth of RMS tumor after cancer cell transplantation in mice. In summary, we suppose that VA decreases HO-1 protein level acting possibly through upregulation of ubiquitin-proteasomal pathway. Inhibitory effect of VE on growth of RMS tumors in vivo indicates that this compound may be considered as a potential drug for treatment of RMS

Nowe czujniki elektrochemiczne do zastosowań w analizie woltamperometrycznej oraz do badań korozji /

Promotor: Bogusław Baś.Niepublikowana praca doktorska.Praca doktorska. Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica w Krakowie. Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, 2014.Bibliogr. k. 155-186.Praca dofinansowana ze środków projektu "Doctus - Małopolski fundusz stypendialny dla doktorantów" współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu SpołecznegoPraca dofinansowana ze środków projektu Accelerated Metallurgy - ufundowanego przez Komisję Europejską w ramach 7 Programu Ramowego i Europejską Agencję KosmicznąPolarografia i woltamperometria, polarografia stałoprądowa DC, woltamperometria z liniową zmianą potencjału LSV, techniki woltamperometrii impulsowej, woltamperometria stripingowa, prąd faradajowski, pojemnościowy i migracyjny, czujniki elektrochemiczne stosowane w polarografii i woltamperometrii, naczynie celki elektrochemicznej, elektrody rtęciowe, metaliczne elektrody błonkowe, stałe elektrody metaliczne, stałe elektrody węglowe, elektrody ceramiczne, transport depolaryzatora do elektrody dyskowej, pierścieniowej i mikroelektrody, teoria i zjawisko zatężania podpotencjałowego UPD, metody mechanicznego przygotowania i elektrochemicznej aktywacji elektrod stałych, odnawialne pierścieniowe elektrody metaliczne, korozja elektrochemiczna i metody badań korozji, rodzaje korozji elektrochemicznej, wpływ środowiska wody morskiej na korozję metali, parametry opisujące kinetykę korozji elektrochemicznej, pomiar i analiza szumu elektrochemicznego, warunki eksperymentalne, aparatura pomiarowa, układ pomiarowy do pomiarów woltamperometrycznych, odczynniki, zasady przygotowania próbek środowiskowych do analizy woltamperometrycznej, ogólne zasady interpretacji woltamperogramów, właściwości fizykochemiczne Ti(C,N) nowy materiał elektrodowy, synteza ceramicznych materiałów elektrodowych wytwarzanych na bazie tytanu, sposób wykonania ceramicznego czujnika woltamperometrycznego, charakterystyka elektrochemiczna ceramicznych czujnikow TiN i Ti(C,N), nowa metoda oznaczania jonów ołowiu i kadmu z wykorzystaniem odnawialnej, pierścieniowej elektrody srebrnej, optymalizacja składu i stężenia elektrolitu podstawowego, optymalizacja instrumentalnych warunków pomiaru, walidacja metody oznaczania jonów ołowiu i kadmu, nowa metoda oznaczania jonów miedzi z wykorzystaniem pierścieniowej elektrody złotej, optymalizacja składu i stężenia elektrolitu podstawowego, optymalizacja instrumentalnych warunków pomiaru, walidacja metody oznaczania jonów miedzi, nowa metoda oznaczania dopaminy w obecności kwasu askorbinowego z wykorzystaniem pierścieniowej elektrody złotej modyfikowanej filmem polidopaminy, sposób modyfikacji elektrody złotej filmem polidopaminy, optymalizacja składu i stężenia elektrolitu podstawowego, optymalizacja instrumentalnych warunków pomiaru, walidacja metody oznaczania dopaminy w obecności kwasu askorbinowego, automatyczny system obsługi (wolt)amperometrycznego czujnika z odnawialną, pierścieniową elektrodą pracującą, badanie korozji metodą pomiaru i analizy szumu elektrochemicznego, zestaw pomiarowy, przygotowanie ogniw korozyjnych, procedura przeprowadzania eksperymentów, stosowana procedura obliczeniowa i metody analizy danych, sposób interpretacji wyników analizy szumu elektrochemicznego, wyniki badań korozji dla ogniwa Al, wyniki badań korozji dla ogniwa Fe, wyniki badań korozji dla ogniwa Fe30Al, wyniki badań dla ogniw wykonanych z Fe o czystości spektralnej, optymalizacja instrumentalnych warunków prowadzenia oznaczeń Pb2+ i Cd2+ na elektrodzie srebrnej, optymalizacja instrumentalnych warunków prowadzenia oznaczeń Cu2+ na elektrodzie złotej, elektrochemiczne nakładanie i utlenianie filmu polidopaminy, optymalizacja instrumentalnych warunków prowadzenia oznaczeń dopaminy na modyfikowanej elektrodzie złotej, oznaczanie dopaminy i kwasu askorbinowego w roztworach o rożnym stężeniu elektrolitu podstawowego, schemat elektroniczny układu sterowania czujnikiem z odnawialną pierścieniową elektrodą pracującą, fotografie mikroskopowe ogniw korozyjnych z elektrodami o płaskich powierzchniach po testach w roztworach NaCl o rożnym pH, system monitoringu korozji elektrochemiczne

Heme oxygenase-1 has a greater effect on melanoma stem cell properties than the expression of melanoma-initiating cell markers

Melanoma-initiating cells (MICs) contribute to the tumorigenicity and heterogeneity of melanoma. MICs are identified by surface and functional markers and have been shown to display cancer stem cell (CSC) properties. However, the existence of MICs that follow the hierarchical CSC model has been questioned by studies showing that single unselected melanoma cells are highly tumorigenic in xenotransplantation assays. Herein, we characterize cells expressing MIC markers (CD20, CD24, CD133, Sca-1, ABCB1, ABCB5, ALDHhigh) in the B16-F10 murine melanoma cell line. We use flow cytometric phenotyping, single-cell sorting followed by in vitro clonogenic assays, and syngeneic in vivo serial transplantation assays to demonstrate that the expression of MIC markers does not select CSC-like cells in this cell line. Previously, our group showed that heme-degrading enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) can be upregulated in melanoma and increase its aggressiveness. Here, we show that HO-1 activity is important for non-adherent growth of melanoma and HO-1 overexpression enhances the vasculogenic mimicry potential, which can be considered protumorigenic activity. However, HO-1 overexpression decreases clone formation in vitro and serial tumor initiation in vivo. Thus, HO-1 plays a dual role in melanoma, improving the progression of growing tumors but reducing the risk of melanoma initiation

Slow-cycling murine melanoma cells display plasticity and enhanced tumorigenicity in syngeneic transplantation assay

Slow-cycling cancer cells (SCC) contribute to the aggressiveness of many cancers, and their invasiveness and chemoresistance pose a great therapeutic challenge. However, in melanoma, their tumor-initiating abilities are not fully understood. In this study, we used the syngeneic transplantation assay to investigate the tumor-initiating properties of melanoma SCC in the physiologically relevant in vivo settings. For this we used B16-F10 murine melanoma cell line where we identified a small fraction of SCC. We found that, unlike human melanoma, the murine melanoma SCC were not marked by the high expression of the epigenetic enzyme Jarid1b. At the same time, their slow-cycling phenotype was a temporary state, similar to what was described in human melanoma. Progeny of SCC had slightly increased doxorubicin resistance and altered expression of melanogenesis genes, independent of the expression of cancer stem cell markers. Single-cell expansion of SCC revealed delayed growth and reduced clone formation when compared to non-SCC, which was further confirmed by an in vitro limiting dilution assay. Finally, syngeneic transplantation of 10 cells in vivo established that SCC were able to initiate growth in primary recipients and continue growth in the serial transplantation assay, suggesting their self-renewal nature. Together, our study highlights the high plasticity and tumorigenicity of murine melanoma SCC and suggests their role in melanoma aggressiveness

Role of heme-oxygenase-1 in biology of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells

Heme oxygenase-1 (HO-1, encoded byHMOX1) is a cytoprotective enzyme degradingheme into CO, $Fe^{2+}$, and biliverdin. HO-1 was demonstrated to affect cardiac differentiation of murinepluripotent stem cells (PSCs), regulate the metabolism of murine adult cardiomyocytes, and influenceregeneration of infarcted myocardium in mice. However, the enzyme’s effect on human cardiogenesisand human cardiomyocytes’ electromechanical properties has not been described so far. Thus, thisstudy aimed to investigate the role of HO-1 in the differentiation of human induced pluripotentstem cells (hiPSCs) into hiPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). hiPSCs were generated fromhuman fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells using Sendai vectors and subjected toCRISPR/Cas9-mediatedHMOX1knock-out. After confirming lack of HO-1 expression on the proteinlevel, isogenic control and HO-1-deficient hiPSCs were differentiated into hiPSC-CMs. No differencesin differentiation efficiency and hiPSC-CMs metabolism were observed in both cell types. The globaltranscriptomic analysis revealed, on the other hand, alterations in electrophysiological pathways inhiPSC-CMs devoid of HO-1, which also demonstrated increased size. Functional consequences inchanges in expression of ion channels genes were then confirmed by patch-clamp analysis. To the bestof our knowledge, this is the first report demonstrating the link between HO-1 and electrophysiologyin human cardiomyocytes