Synthesis of modified nucleosides and modified oligodeoxynucleotides for DNS analytics

1.) Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf einem Sonden-Array Innerhalb des Projektes sollte ein Verfahren entwickelt werden, dass zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf Sonden-Arrays genutzt werden kann. Der prinzipielle Aufbau dieses Testsystems wird in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Einer der entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses Verfahrens, ist die Einführung einer selektiv spaltbaren Bindung innerhalb der DNA. Die von uns hierfür präferierte Bindung ist die 5´-O-P-S-3´ Bindung. Das erste zu realisierende Ziel bestand damit in der Synthese der entsprechend 5´-Thio-modifizierten Amidite. Die Synthese von 4,4´-Dimethoxytriphenylmethanthiol, als alternative Schwefel-Quelle und gleichzeitig temporäre 5´-Schutzgruppe stellt den Schlüsselschritt der erfolgreichen Synthese dar. Mit Hilfe dieser Strategie gelingt es, die entsprechend benötigten modifizierten Amidite in zufriedenstellender Ausbeute herzustellen. Durch die Anwendung eines modifizierten Synthesezyklus ist die Synthese eines entsprechend Schwefel-modifizierten Modelloligodesoynukleotids möglich. Mit Hilfe dieser Verbindung wurde die erwünschte Spaltung der 5´-O-P-S-3´ Bindung mit Silbernitrat in Lösung und an verschiedenen Oberflächen (Chip, Biacore-Chip und Magnetic Beads) untersucht. 2.) Punktmutationsdetektion durch festphasenvermittelte Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) und MALDI-MS Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen, elektrophoresefreien Verfahrens zur Detektion von bekannten Punktmutationen mittels fester Phase und der MALDI-Massenspektrometrie. Hierfür wird zunächst ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches später als Primer fungiert, über einen photolytisch spaltbaren Linker an eine feste Phase gebunden. Dessen Oligodesoxynukleotid-Sequenz wird dabei so ausgewählt, daß sie komplementär zur Zielsequenz einer mutierten DNA ist und direkt vor der zu detektierenden Punktmutation endet. Durch eine enzymatische Polymerasereaktion wird der Primer dann um eine Base, die entweder komplementär zur korrekten DNA oder zur Mutation ist, verlängert. Das Reaktionsprodukt kann dann direkt mittels MALDI-MS photolytisch von der festen Phase getrennt und analysiert werden. Die Masse des Reaktionsproduktes ist festgelegt durch den erfolgten Einbau einer von vier Nukleobasen und gibt daher unmittelbar Auskunft über das Vorhandensein einer Punktmutation. Zunächst sollte die prinzipielle Durchführbarkeit des Projekts erarbeitet werden. Wesentliche Vorteile dieser neuen Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wären der außerordentlich geringe Zeitaufwand und die unmittelbare Detektion ohne Label. Das hier entwickelte Konstrukt gestaltete sich allerdings für die Anwendung als ein Standardanalyseverfahren zu komplex, da für die Detektion von Punktmutationen aussagekräftigere und einfachere Verfahren bereits zur Verfügung stehen, der hier beobachtete Spaltungs-mechanismus wirft jedoch einige Fragen auf. Für einen Einsatz als photolabiles Trägermaterial ist dieses Konstrukt jedoch ebenfalls zu kompliziert. 3.) Verknüpfungsreaktionen von Acetal-geschützten Oligodesoxynukleotiden mit Hydrazin-modifizierten Derivaten Die effektive Konjugation von modifizierten Oligodesoxynukleotiden und Hydrazin-Derivaten durch die Verwendung einer 5´-Acetalfunktion konnte hier durch die Verwendung eines aromatischen Phosphitylierungsreagenz gezeigt werden. Das hergestellte 5´-Acetal-modifizierte Oligodesoxynukleotid fungiert hier als ein maskiertes 5´-Aldehyd. Der Einsatz des maskierten Acetals weist gegenüber dem reaktiven Aldehyd-Derivat mehrere Vorteile auf: es ist lagerstabil, gut handhabbar und stabil gegenüber den Bedingungen der Oligodesoxynukleotid-Synthese. Ein aromatisches Acetal-geschützte Oligodesoxynukleotid kann in einer Eintopfreaktion mit einem entsprechenden Hydrazin-Derivat umgesetzt werden. Das verwendete Hydrazin-Derivat muß jedoch als Hydrochlorid oder als Trifluoracetat eingesetzt werden. Die Reaktion erfolgt in wässriger methanolischer Lösung durch den Zusatz von Natriumacetat, dieses katalysiert die Reaktion. Durch den Einsatz von Methanol als Lösungsmittel kann der Reaktionsansatz direkt mit Hilfe der HPL-Chromatographie gereinigt werden. Die Umsetzung des Acetal-modifizierten Oligodesoxynukleotids wurde mit verschiedenen Hydrazinen durchgeführt. Die mit den Hydrazinen erreichten Ausbeuten übersteigen bei weitem (Ausnahme Biotin) die der entsprechenden Aktivester. Vorallem das Arbeiten in wässriger Lösung erleichtert die Synthese und die Aufreinigung. Hiermit steht eine 5´-Modifikation zur Verfügung, die eine Konjugation mit Hydrazin-Derivaten in sehr guten Ausbeuten ermöglicht

Chronic Activation of Hepatic Nrf2 Has No Major Effect on Fatty Acid and Glucose Metabolism in Adult Mice

The transcription factor NF-E2-related factor 2 (Nrf2) induces cytoprotective genes, but has also been linked to the regulation of hepatic energy metabolism. In order to assess the pharmacological potential of hepatic Nrf2 activation in metabolic disease, Nrf2 was activated over 7 weeks in mice on Western diet using two different siRNAs against kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), the inhibitory protein of Nrf2. Whole genome expression analysis followed by pathway analysis demonstrated successful knock-down of Keap1 expression and induction of Nrf2-dependent genes involved in anti- oxidative stress defense and biotransformation, proving the activation of Nrf2 by the siRNAs against Keap1. Neither the expression of fatty acid- nor carbohydrate-handling proteins was regulated by Keap1 knock-down. Metabolic profiling of the animals did also not show effects on plasma and hepatic lipids, energy expenditure or glucose tolerance. The data indicate that hepatic Keap1/Nrf2 is not a major regulator of glucose or lipid metabolism in mice

Structural comparison of oligoribonucleotides and their 2 -Deoxy-2 -fluoro analogs by heteronuclear NMR spectroscopy

1-(2-Deoxy-2-fluororibofuranosyl)pyrimidines were synthesized and incorporated into an RNA oligonucleotide to give 5-r[CfGCf(UfUfCfG)GCfG]-3 (Cf: short form of Cd2f2 = 2-deoxy-2-fluorocytidine; Uf: short form of Ud2f2 = 2-deoxy-2-fluorouridine). The oligomer was investigated by means of UV, CD, and NMR spectroscopy to address the question of how F-labels can substitute 13C-labels in the ribose ring. Through-space (NOE) and through-bond (scalar couplings) experiments were performed that make use of the ameliorated chemical-shift dispersion induced by 19F as an alternative heteronucleus. A comparison of the structures of fluorinated vs. unmodified oligomer is given. It turns out that the fluorinated oligonucleotide exists in a 14:3 equilibrium between a hairpin and a duplex conformation, in contrast to the unmodified oligonucleotide which predominantly adopts the hairpin conformation. Furthermore, the fluorinated hairpin structure adopts two distinct conformations that differ in the sugar conformation of the U and C nucleoside units, as detected by the 19F-NMR chemical shifts. The role of the 2-OH group as stabilizing element in RNA secondary structure is discussed

A siRNA mediated hepatic dpp4 knockdown affects lipid, but not glucose metabolism in diabetic mice.

Systemic inhibition of dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) represents an effective and established treatment option for type 2 diabetes (T2D). The current study investigated in mice if a liver selective knock-down of dpp4 by therapeutic siRNAs could be a novel, similarly effective treatment option for T2D. Furthermore, the potential effects on hepatic steatosis, inflammation and lipid metabolism were investigated after hepato-selective knock-down of dpp4. The knock-down efficiency and IC50 values of siRNAs targeting dpp4 were analyzed in PC3 cells. In two independent studies, either db/db mice or C57BL/6J mice were injected intravenously with a liposomal formulation of siRNAs targeting either dpp4 or a non-targeting control, followed by metabolically characterization. In comparator groups, additional cohorts of mice were treated with an oral dpp4 inhibitor. In both animal studies, we observed a robust knock-down (~75%) of hepatic dpp4 with a potent siRNA. Hepatic dpp4 knockdown did not significantly affect glucose metabolism or circulating incretin concentrations in both animal studies. However, in obese and diabetic db/db mice hepatic steatosis was reduced and hepatic mRNA expression of acaca, scd1, fasn and pparg was significantly lower after siRNA treatment. Systemic inhibition of the enzymatic dpp4 activity by an oral dpp4 inhibitor significantly improved glucose handling in db/db mice but did not affect hepatic endpoints. These data demonstrate that a targeted reduction of dpp4 expression in the liver may not be sufficient to improve whole-body glucose metabolism in obese and diabetic mice but may improve hepatic lipid metabolism

Inhibition of citrate cotransporter Slc13a5/mINDY by RNAi improves hepatic insulin sensitivity and prevents diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in mice

Objective: Non-alcoholic fatty liver disease is a world-wide health concern and risk factor for cardio-metabolic diseases. Citrate uptake modifies intracellular hepatic energy metabolism and is controlled by the conserved sodium-dicarboxylate cotransporter solute carrier family 13 member 5 (SLC13A5, mammalian homolog of INDY: mINDY). In Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans INDY reduction decreased whole-body lipid accumulation. Genetic deletion of Slc13a5 in mice protected from diet-induced adiposity and insulin resistance. We hypothesized that inducible hepatic mINDY inhibition should prevent the development of fatty liver and hepatic insulin resistance. Methods: Adult C57BL/6J mice were fed a Western diet (60% kcal from fat, 21% kcal from carbohydrate) ad libitum. Knockdown of mINDY was induced by weekly injection of a chemically modified, liver-selective siRNA for 8 weeks. Mice were metabolically characterized and the effect of mINDY suppression on glucose tolerance as well as insulin sensitivity was assessed with an ipGTT and a hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Hepatic lipid accumulation was determined by biochemical measurements and histochemistry. Results: Within the 8 week intervention, hepatic mINDY expression was suppressed by a liver-selective siRNA by over 60%. mINDY knockdown improved hepatic insulin sensitivity (i.e. insulin-induced suppression of endogenous glucose production) of C57BL/6J mice in the hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Moreover, the siRNA-mediated mINDY inhibition prevented neutral lipid storage and triglyceride accumulation in the liver, while we found no effect on body weight. Conclusions: We show that inducible mINDY inhibition improved hepatic insulin sensitivity and prevented diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in adult C57BL6/J mice. These effects did not depend on changes of body weight or body composition. Keywords: INDY/Slc13a5, siRNA, Insulin resistance, Steatosis, Citrate transport, Lipid accumulatio

Correction: Chronic Activation of Hepatic Nrf2 Has No Major Effect on Fatty Acid and Glucose Metabolism in Adult Mice.

[This corrects the article DOI: 10.1371/journal.pone.0166110.]