mRNP3 and mRNP4 are phosphorylatable by casein kinase II in Xenopus oocytes, but phosphorylation does not modify RNA-binding affinity

AbstractmRNP3 and mRNP4 (also called FRGY2) are two mRNA-binding proteins which are major constituents of the maternal RNA storage particles of Xenopus laevis oocytes. The phosphorylation of mRNP3–4 has been implicated in the regulation of mRNA masking. In this study, we have investigated their phosphorylation by casein kinase II and its consequence on their affinity for RNA. Comparison of the phosphopeptide map of mRNP3–4 phosphorylated in vivo with that obtained after phosphorylation in vitro by purified Xenopus laevis casein kinase II strongly suggests that casein kinase II is responsible for the in vivo phosphorylation of mRNP3–4 in oocytes. The phosphorylation occurs on a serine residue in a central domain of the proteins. The affinity of mRNP3–4 for RNA substrates remained unchanged after the treatment with casein kinase II or calf intestine phosphatase in vitro. This suggests that phosphorylation of these proteins does not regulate their interaction with RNA but rather controls their interactions with other proteins

Caractérisation du rôle d'Unr, une protéine de liaison à l'ARN, dans les cellules souches embryonnaires murines

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d ARN messagers cibles. L invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu il est possible d étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s auto-renouveler c est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d Unr. La restauration de l expression d Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d action d Unr. Nous avons fait l hypothèse qu Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d Unr. Une augmentation modérée de l expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif.Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.BORDEAUX2-Bib. électronique (335229905) / SudocSudocFranceF

Identification de nouveaux gènes de sensibilité aux agents antitumoraux par sélection d'éléments génétiques suppresseurs (modulation de la sensibilité cellulaire aux dommages de l'ADN par des protéines Arginine N-Methyltransférases)

PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocCentre Technique Livre Ens. Sup. (774682301) / SudocCACHAN-ENS (940162301) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Bleomycin resistance in mammalian cells expressing a genetic suppressor element derived from the SRPK1 gene

The genetic suppressor element (GSE) approach allows identification of genes essential for certain cell phenotypes. To identify genes controlling the cell response to cytotoxic agents, a normalized retroviral library of randomly fragmented cDNAs from the Chinese hamster cell line DC-3F was screened for GSEs conferring resistance to bleomycin. One of these GSEs, GSE(BLM), conferring an approximately 2-fold bleomycin resistance in DC-3F cells, displayed 98% identity with an amino acid sequence located in the functional domain of human SRPK1. Using GSE(BLM) as a probe, we cloned a cDNA with a nucleotide sequence that was 76.7% identical to that of human SRPK1, whereas the corresponding amino acid sequence was 92.6% identical to that of this enzyme. When GSE(BLM), inserted in the retroviral vector pLNCX, was transduced in HeLa cells, its expression resulted in a 5-10-fold bleomycin resistance, which was abolished when these cells were further transfected with SRPK1 cDNA. In our experimental conditions, DC-3F or HeLa cells expressing GSE(BLM) did not show any detectable cross-resistance to other cytotoxic agents with various mechanisms of action. GSE(BLM), which is sense oriented in the vector, is likely to be translated in a peptide active as a dominant-negative inhibitor of SRPK1. SRPK1 is a protein serine kinase that regulates the activity of RS-proteins (arginine-serine-rich proteins), a group of nuclear factors controlling various physiological processes

Synthesis of N‐(9H‐Xanthen‐9‐yl)aminoalkanamide and N‐(9H‐Thioxanthen‐9‐yl)aminoalkanamide Derivatives and their in vitro Evaluation as Potential Intercalators and Antitumor Drugs

A series of new N‐(9H‐xanthen‐9‐yl)aminoalkanamide and N‐(9H‐thio‐xanthen‐9‐yl)aminoalkanamide derivatives was synthesized and evaluated as potential intercalators by measuring their DNA binding affinity. They were also tested for cytotoxic activity against L1210. The results suggest that the cytotoxicity of these molecules was not due to an intercalating mechanism. Copyright © 1994 WILEY‐VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinhei