MicroRNA Regulation of Cell Lineages in Mouse and Human Embryonic Stem Cells

SummaryCell fate decisions of pluripotent embryonic stem (ES) cells are dictated by activation and repression of lineage-specific genes. Numerous signaling and transcriptional networks progressively narrow and specify the potential of ES cells. Whether specific microRNAs help refine and limit gene expression and, thereby, could be used to manipulate ES cell differentiation has largely been unexplored. Here, we show that two serum response factor (SRF)-dependent muscle-specific microRNAs, miR-1 and miR-133, promote mesoderm formation from ES cells but have opposing functions during further differentiation into cardiac muscle progenitors. Furthermore, miR-1 and miR-133 were potent repressors of nonmuscle gene expression and cell fate during mouse and human ES cell differentiation. miR-1's effects were in part mediated by translational repression of the Notch ligand Delta-like 1 (Dll-1). Our findings indicate that muscle-specific miRNAs reinforce the silencing of nonmuscle genes during cell lineage commitment and suggest that miRNAs may have general utility in regulating cell-fate decisions from pluripotent ES cells

microRNAs as Developmental Regulators

The field of miRNA biology is relatively young, but its impact on our understanding of the regulation of a wide array of cell functions is far-reaching. The importance of miRNAs in development has become nearly ubiquitous, with miRNAs contributing to development of most cells and organs. Although miRNAs are clearly interwoven into known regulatory networks that control cell development, the specific modalities by which they intersect are often quite distinct and cleverly achieved. The frequently emerging theme of feed-back and feed-forward loops to either counterbalance or reinforce the gene programs that they influence is a common thread. Many of these examples of miRNAs as developmental regulators are presently found in organs with different miRNAs and targets, whereas novel, unexpected themes emerge in the context of mouse development as we learn more about this rapidly developing area of biology

MicroRNAs in cardiac development.

The transcriptional regulation of cardiovascular development requires precise spatiotemporal control of gene expression, and heterozygous mutations of transcription factors have frequently been implicated in human cardiovascular malformations. A novel mechanism involving post-transcriptional regulation by small, noncoding microRNAs (miRNAs) has emerged as a central regulator of many cardiogenic processes. We are beginning to understand the functions that miRNAs play during essential biologic processes, such as cell proliferation, differentiation, apoptosis, stress response, and tumorigenesis. The identification of miRNAs expressed in specific cardiac and vascular cell types has led to the discovery of important regulatory roles for these small RNAs during cardiomyocyte differentiation, cell cycle, conduction, and vessel formation. Here, we overview the recent findings on miRNA regulation in cardiovascular development. Further analysis of miRNA function during cardiovascular development will allow us to determine the potential for novel miRNA-based therapeutic strategies

MicroRNAs in cardiac development.

The transcriptional regulation of cardiovascular development requires precise spatiotemporal control of gene expression, and heterozygous mutations of transcription factors have frequently been implicated in human cardiovascular malformations. A novel mechanism involving post-transcriptional regulation by small, noncoding microRNAs (miRNAs) has emerged as a central regulator of many cardiogenic processes. We are beginning to understand the functions that miRNAs play during essential biologic processes, such as cell proliferation, differentiation, apoptosis, stress response, and tumorigenesis. The identification of miRNAs expressed in specific cardiac and vascular cell types has led to the discovery of important regulatory roles for these small RNAs during cardiomyocyte differentiation, cell cycle, conduction, and vessel formation. Here, we overview the recent findings on miRNA regulation in cardiovascular development. Further analysis of miRNA function during cardiovascular development will allow us to determine the potential for novel miRNA-based therapeutic strategies

The paradoxical patent ductus arteriosus

The ductus arteriosus (DA) is a vessel whose patency is required for fetal survival but is incompatible with postnatal life. Because of developmental insufficiency, the DA in preterm infants often fails to close in a condition known as patent DA (PDA). Although COX inhibitors can be used to close the PDA by lowering circulating prostaglandin levels, their effectiveness is correlated with birth weight, and severely premature infants often require surgical repair. Paradoxically, targeted deletion of COX pathway components in mice results in PDA. In this issue of the JCI, Yokoyama et al. describe dual roles for prostaglandins in DA development and closure, offering new insights into the mechanism of negative effects of COX inhibitors that may influence the treatment of severely premature infants with PDA and lead to improvement of their outcomes (see the related article beginning on page 3026)

The E3 ubiquitin ligase Nedd4/Nedd4L is directly regulated by microRNA 1.

miR-1 is a small noncoding RNA molecule that modulates gene expression in heart and skeletal muscle. Loss of Drosophila miR-1 produces defects in somatic muscle and embryonic heart development, which have been partly attributed to miR-1 directly targeting Delta to decrease Notch signaling. Here, we show that overexpression of miR-1 in the fly wing can paradoxically increase Notch activity independently of its effects on Delta. Analyses of potential miR-1 targets revealed that miR-1 directly regulates the 3'UTR of the E3 ubiquitin ligase Nedd4 Analysis of embryonic and adult fly heart revealed that the Nedd4 protein regulates heart development in Drosophila Larval fly hearts overexpressing miR-1 have profound defects in actin filament organization that are partially rescued by concurrent overexpression of Nedd4. These results indicate that miR-1 and Nedd4 act together in the formation and actin-dependent patterning of the fly heart. Importantly, we have found that the biochemical and genetic relationship between miR-1 and the mammalian ortholog Nedd4-like (Nedd4l) is evolutionarily conserved in the mammalian heart, potentially indicating a role for Nedd4L in mammalian postnatal maturation. Thus, miR-1-mediated regulation of Nedd4/Nedd4L expression may serve to broadly modulate the trafficking or degradation of Nedd4/Nedd4L substrates in the heart

Investigation of auditory processing of two-syllabic speech sounds in infants at the age of 4 weeks and 5 month with event-related potentials

Inhaltsverzeichnis 0. Titel und Inhaltsverzeichnis 0 1. Einleitung 5 1.1 Sprachentwicklungsstörung und spezifische Sprachentwicklungsstörung 5 1.2 Zeitliche Verarbeitung 7 1.2.1 Entwicklung der zeitlichen Verarbeitung 7 1.2.2 Zeitliche Verarbeitung und SES 8 1.3 Neuroradiologische Verfahren zur Untersuchung von SES 9 1.4 Neurophysiologische Grundlagen 10 1.5 Vom Elektroenzephalogramm (EEG) zum ereigniskorrelierten Potenzial (EKP) 11 1.6 Kortikale akustisch evozierte Potenziale 11 1.6.1 Einfluss der Vigilanz auf die kortikalen akustisch evozierten Potenziale 12 1.6.2 Entwicklung der kortikalen akustisch evozierten Potenziale 12 1.6.3 Kortikale akustisch evozierte Potenziale und SES 13 1.7 Mismatch Negativity (MMN) 14 1.7.1 Erklärungsmodell der MMN 15 1.7.2 Generatoren der MMN 16 1.7.3 Einfluss der Vigilanz auf die MMN 16 1.7.4 MMN bei Erwachsenen 17 1.7.5 MMN bei Neugeborenen und Säuglingen 18 1.7.6 Unterschiede zwischen der MMN bei Erwachsenen und Kindern 19 1.7.7 MMN und SES 20 2. Fragestellung und Hypothesen 22 3. Material und Methoden 24 3.1 Stichprobe 24 3.1.1 Rekrutierung 24 3.1.2 Beschreibung der Stichprobe 24 3.1.3 Einschlusskriterien 25 3.1.4 Pädiatrische Begleituntersuchungen 26 3.1.4.1 Neurologische Untersuchung nach Prechtl 26 3.1.4.2 Beurteilung der Kinder nach Griffith 27 3.1.5 Überprüfung der Hörfunktion 27 3.2 Untersuchungsablauf 28 3.3 EKP-Experiment 28 3.3.1 Messaufbau 28 3.3.1.1 Elektroden 29 3.3.1.2 Hardware 30 3.3.1.3 Software 31 3.3.1.3.1 Reizausgabe 31 3.3.1.3.2 Aufzeichnung der Messwerte 31 3.3.1.3.3 Messdatenverarbeitung 31 3.3.2 Vigilanzkontrolle 32 3.3.3 Stimulusmaterial 33 3.4 Datenaufarbeitung 36 3.4.1 Rereferenzierung 36 3.4.2 Filterung 37 3.4.3 Artefaktbereinigung 37 3.4.4 Mittelung und Differenzbildung 38 3.5 Parametrisierung 38 3.6 Statistische Auswertung 38 4. Ergebnisse 40 4.1 Kortikale Potenzialantworten auf die Standardreize 40 4.1.1 Erwachsene Probanden 40 4.1.2 Säuglinge im Alter von 4 Wochen 46 4.1.3 Säuglinge im Alter von 5 Monaten 55 4.2 Mismatch-Antworten auf die Doppelsilben mit kurzer bzw. langer Pause 63 4.2.1 Erwachsene Probanden 63 4.2.2 Säuglinge im Alter von 4 Wochen 71 4.2.3 Säuglinge im Alter von 5 Monaten 75 5. Diskussion 80 5.1 Diskussion zu den Ergebnissen der kortikalen Potenzialantworten 80 5.1.1 Entwicklung der kortikalen Potenzialantworten 80 5.1.2 Einfluss der Vigilanz auf die kortikalen Potenzialantworten 82 5.1.3 Einfluss des Geschlechts auf die kortikalen Potenzialantworten 83 5.2 Diskussion zu den Ergebnissen des Mismatch-Paradigmas 86 5.2.1 Erwachsene Probanden 86 5.2.2 Säuglinge im Alter von 4 Wochen und 5 Monaten 88 5.2.3 Altersentwicklung und Reifung der Mismatch-Antworten 91 5.2.4 Einfluss der Vigilanz auf die Mismatch-Antworten 93 5.2.5 Einfluss des Geschlechts auf die Mismatch-Antworten 93 5.2.6 Methodenkritische Erörterungen und relevante Aspekte für eine perspektivische Nutzung des Mismatch-Paradigmas im klinischen Alltag 94 6. Zusammenfassung 97 7. Literaturverzeichnis 101 8. Anhang 110 8.1 Fragebogen zur Risikoanamnese Sprachentwicklung 110 8.2 Versuchsprotokoll 112 8.3 Vigilanzstadieneinteilung während der laufenden Untersuchung 113 8.4 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse aus den berechneten Varianzanalysen 114 8.4.1 Ergebnisse aus den Berechnungen für die kortikalen Potenzialantworten 114 8.4.1.1 Erwachsene Probanden 114 8.4.1.2 Säuglinge im Alter von 4 Wochen 115 8.4.1.3 Säuglinge im Alter von 5 Monaten 119 8.4.2 Ergebnisse aus den Berechnungen für die Mismatch-Antworten 126 8.4.2.1 Erwachsene Probanden 126 8.4.2.2 Säuglinge im Alter von 4 Wochen 127 8.4.2.3 Säuglinge im Alter von 5 Monaten 129 8.5 Danksagung 130Eine Basisfunktion für den ungestörten Spracherwerb stellt die Phonemdiskrimination dar, die unter anderem Fähigkeiten der zeitlichen Verarbeitung, wie z.B. die exakte Analyse zeitlicher Merkmale sowie eine ausreichende Verarbeitungsgeschwindigkeit voraussetzen. Die Messung akustisch evozierter Potenziale (AEP) sowie deren Teilkomponente Mismatch Negativity (MMN) stellen ein objektives Verfahren zur elektrophysiologischen Darstellung der Phonemdiskrimination bzw. der Fähigkeiten der zeitlichen Verarbeitung bei Säuglingen dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, die auditive Verarbeitung von schnellen Reizfolgen sowie den Einfluss der zeitlichen Struktur eines Reizes auf die Phonemdiskrimination bei Säuglingen (n=47) im Alter von 4 Wochen sowie im Alter von 5 Monaten mittels dieses Verfahrens zu untersuchen. Des Weiteren sollte das Studiendesign an 24 erwachsenen Kontrollpersonen evaluiert werden. Als akustisches Reizmaterial wurden Doppelsilben verwendet, die sich im Phonem der zweiten Silbe unterschieden (Standardreiz: /da/-/da/ versus Deviantreiz: /da/-/ba/). Dabei variierte die Pausenlänge zwischen den Silben in zwei unterschiedlichen Bedingungen, zum einen mit 50 ms und zum anderen mit 150 ms. In den gemittelten Standardantworten dominierte bei den Kindern im Alter von 4 Wochen um 290 ms auf die erste Silbe im Doppelreiz eine Positivierung. Auf die zweite Silbe stellte sich eine verminderte Reizantwort dar. Dieser Beobachtung wurde eine unvollständige Verarbeitung der zweiten Silbe als Folge von interferierenden Prozessen bei schneller Reizfolge (Maskierung) zugeschrieben. Bei einer Wiederholungsmessung nach 4 Monaten ließen sich neben einer Verminderung des Maskierungseffekts, eine Latenzabnahme, eine Amplitudenzunahme sowie morphologische Veränderungen in den kortikalen Potenzialantworten dokumentieren. Bei der Auswertung der Differenzkurven ergaben sich in der adulten Kontrollgruppe auf die Bedingung mit kurzer Pause (50 ms) zwei negative Komponenten (MMN I und MMN II). Für die Bedingung mit langer Pause (150 ms) stellte sich dagegen nur eine negative Auslenkung (MMN I) dar. Mit diesem Ergebnis konnte veranschaulicht werden, dass akustische Reize zum einen jeweils separat verarbeitet (MMN I) und zum anderen abhängig von der Pausenlänge zwei Reize auch als akustische Einheit zusammenfasst (MMN II) werden. In der Säuglingsgruppe konnte überraschenderweise keine signifikante MMN evoziert werden. Jedoch zeigte sich ab dem 5. Lebensmonat auf die Doppelsilben mit langer Pause eine positive Komponente in der Differenzkurve. Es gibt Hinweise darauf, dass dieser Positivierung möglicherweise ein Diskriminationsprozess zugeordnet werden kann. Auf die Doppelsilben mit kurzer Pause stellte sich jedoch keine solche Positivierung dar. Es lässt sich somit vermuten, dass aus einer zeitlichen Komprimierung des Stimulusmaterials eine schlechtere auditive Verarbeitung resultierte. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Objektivierung der auditiven Verarbeitung und Diskrimination bei Kindern mittels der AEP bzw. MMN möglich ist. Statistisch abgesicherte Daten konnten jedoch nur bei der Auswertung auf Gruppenebene erhoben werden. Zur Evaluierung individueller Potenzialantworten bedarf es der Untersuchung größerer Probandenkollektive.The mismatch negativity (MMN) is a component of event-related potentials (ERPs) and reflects passive change detection. The present study tested the discrimination processing of phonemes and the temporal processing in infants with the ERPs and MMN. 47 children (33 boys and 14 girls) without a family history for SLI and dyslexia, neurological and developmental deficits were evaluated in a longitudinal study at the age of 4 weeks and 5 month by presenting a mismatch paradigm. Frequent standard stimuli were two-syllabic speech sounds (/da/-/da/). Deviant stimuli differed from the standard stimuli in the phoneme of the second syllable (/da/-/ba/). The dependency of the temporal structure of a speech sound to the discrimination processing of phonemes was measured by comparing two conditions with different duration of the gap between the two syllables. A gap duration of 50 ms was presented in experiment 1 (/da/50 ms/da/ versus /da/50 ms/ba/), whereas a gap duration of 150 ms was tested in experiment 2 (/da/150 ms/da/ versus /da/150 ms/ba/). The difference waves to condition 1 and 2 showed no significant MMN at the age of 4 weeks and 5 month. In the difference wave to condition 2 (/da/150 ms/da/ versus /da/150 ms/ba/) appeared a broad positivity after change onset at the age of 5 month. The present study suggests that this positivity is a correlative to the adult MMN in infants. The results show that ERPs and the component MMN can be used to investigate the passive change detection and the temporal processing in infants

Limited gene expression variation in human embryonic stem cell and induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells.

Recent evidence suggests human embryonic stem cell (hESC) and induced pluripotent stem (iPS) cell lines have differences in their epigenetic marks and transcriptomes, yet the impact of these differences on subsequent terminally differentiated cells is less well understood. Comparison of purified, homogeneous populations of somatic cells derived from multiple independent human iPS and ES lines will be required to address this critical question. Here, we report a differentiation protocol based on embryonic development that consistently yields large numbers of endothelial cells (ECs) derived from multiple hESCs or iPS cells. Mesoderm differentiation of embryoid bodies was maximized, and defined growth factors were used to generate KDR(+) EC progenitors. Magnetic purification of a KDR(+) progenitor subpopulation resulted in an expanding, homogeneous pool of ECs that expressed EC markers and had functional properties of ECs. Comparison of the transcriptomes revealed limited gene expression variability between multiple lines of human iPS-derived ECs or between lines of ES- and iPS-derived ECs. These results demonstrate a method to generate large numbers of pure human EC progenitors and differentiated ECs from pluripotent stem cells and suggest individual lineages derived from human iPS cells may have significantly less variance than their pluripotent founders