130 research outputs found

    Fabrication and characterization of nanoparticles/PMMA electrospun nanofiber membranes

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    Currently, one of the most serious problems is to maintain the water balance in terms of quality and quantity. In recent times, membrane technology is considered to be essential as it ensures high water quality with low cost and maintenance of sustainable water resources. In this work different membranes were fabricated by electrospinning technique. PMMA (polymethyl methacrylate) was used as a base polymer material and the silver nanoparticles, silver nanowires or titanium dioxide were incorporated into the matrix. The aim was to produce polymeric membranes containing nanoparticles, fabricated by electrospinning in order to obtain the highest bactericidal effect for water treatment. The bactericidal effect was observed for three kinds of membranes however, the best results were obtained by the silver nanoparticles membrane with the in situ manufacturing method. The distribution of the nanoparticles in this membrane resulted more uniform, the size of the nanoparticles was smaller and the texture was the most mechanically resistant

    Characterization of polycaprolactone/mesoporous silica composite membranes

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    In the present project polycaprolactone (PCL) with mesoporous silica (MCM 41) as filler based membranes were prepared and characterized. PCL was chosen because it is biocompatible, biodegradable and has an excellent tensile strength. Because of these characteristics PCL has found diverse applications in several fields: packaging, tissue engineering, drug delivery, etc. MCM-41 is a mesoporous material with hexagonal arrangement of uniform mesopores, highly specific surface (up to 1500 m2/g), and adjustable pore diameter (2 10 nm). Composite membranes were prepared by casting and solvent evaporation method. The inorganic loading of the membranes was measured by Thermogravimetric Analysis (TGA) while structure and morphology were analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscope (SEM). Permeability test were carried out in a home-made experimental plant. The gases used for permeation were oxygen and carbon dioxide. Theoretical and experimental selectivity were compared. Incorporating MCM-41 nanoparticles reduced O2 and CO2 permeation around 20% and 80% respectively, compared to pristine PCL. Also, incorporating these nanoparticles functionalized with EPTES caused a greater decrease in O2 and CO2 permeation, 26% and 90% respectively. For both composite membranes a higher O2/CO2 selectivity was obtained

    Aerosoles formados por nanomateriales: Monitorización y evaluación de la exposición en entornos laborales

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    La Nanotecnología es un conocimiento clave para el desarrollo de futuras innovaciones y nuevos productos. A pesar de los innegables beneficios que pueden resultar de su desarrollo, existe una creciente preocupación entre la comunidad científica y algunos gobiernos por el riesgo para la salud que supone la presencia de materiales totalmente nuevos. En respuesta al creciente interés social en Nanoseguridad, la presente tesis ha pretendido avanzar en el conocimiento relacionado con las emisiones producidas durante la manipulación de distintos materiales nanopartículados y la monotorización y evaluación de la exposición en entornos laborales. Esta tesis doctoral está presentada como Compendio de 8 publicaciones con unidad temática

    Microflow nanoprecipitation of positively charged gastroresistant polymer nanoparticles of Eudragit® RS100: A study of fluid dynamics and chemical parameters

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    The objective of the present work was to produce gastroresistant Eudragit® RS100 nanoparticles by a reproducible synthesis approach that ensured mono-disperse nanoparticles under the size of 100 nm. Batch and micromixing nanoprecipitation approaches were selected to produce the demanded nanoparticles, identifying the critical parameters affecting the synthesis process. To shed some light on the formulation of the targeted nanoparticles, the effects of particle size and homogeneity of fluid dynamics, and physicochemical parameters such as polymer concentration, type of solvent, ratio of solvent to antisolvent, and total flow rate were studied. The physicochemical characteristics of resulting nanoparticles were studied applying dynamic light scattering (DLS) particle size analysis and electron microscopy imaging. Nanoparticles produced using a micromixer demonstrated a narrower and more homogenous distribution than the ones obtained under similar conditions in conventional batch reactors. Besides, fluid dynamics ensured that the best mixing conditions were achieved at the highest flow rate. It was concluded that nucleation and growth events must also be considered to avoid uncontrolled nanoparticle growth and evolution at the collection vial. Further, rifampicin-encapsulated nanoparticles were prepared using both approaches, demonstrating that the micromixing-assisted approach provided an excellent control of the particle size and polydispersity index. Not only the micromixing-assisted nanoprecipitation promoted a remarkable control in the nanoparticle formulation, but also it enhanced drug encapsulation efficiency and loading, as well as productivity. To the best of our knowledge, this was the very first time that drug-loaded Eudragit® RS100 nanoparticles (NPs) were produced in a continuous fashion under 100 nm (16.5 ± 4.3 nm) using microreactor technology. Furthermore, we performed a detailed analysis of the influence of various fluid dynamics and physicochemical parameters on the size and uniformity of the resulting nanoparticles. According to these findings, the proposed methodology can be a useful approach to synthesize a myriad of nanoparticles of alternative polymers

    Smart dressings based on nanostructured fibers containing natural origin antimicrobial and anti-inflammatory compounds

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    La presente tesis doctoral denominada “Apósitos inteligentes basados en la encapsulación de compuestos antimicrobianos y anti-inflamatorios de origen natural en fibras nanoestructuradas” ha sido desarrollada en el Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medioambiente (Universidad de Zaragoza, España) en el Grupo de Películas y Partículas Nanoestructuradas (NFP), miembro del Instituto de Nanociencia de Aragón (INA). Parte de la investigación ha sido desarrollada en el Centro de Investigación Biomédica de Aragón (CIBA). Durante este periodo, se ha realizado una estancia de 6 meses en el Methodist Hospital Research Institute en Houston (Texas, US), supervisada por el Profesor Ennio Tasciotti. La tesis ha sido financiada por el Programa de Formación de Personal Investigador (FPI) proporcionado por el Ministerio de Economía y Competitividad de España (CTQ2014-52384-R). La estancia fue co-financiada por el Centro de Investigación Biomédica en Red en el campo de la Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN). Debido al desarrollo de resistencias bacterianas, el interés en la búsqueda de nuevos compuestos para abordar infecciones ha crecido exponencialmente para los investigadores. Por este motivo, esta tesis doctoral está enfocada en el diseño de un apósito basado en nanofibras de policaprolactona (PCL) sintetizadas mediante electrospinning, que encapsulen compuestos naturales que actúen como anti-inflamatorios y antimicrobianos para el tratamiento de heridas. Con este objetivo, se ha llevado a cabo un profundo estudio de los aceites esenciales con propiedades bactericidas y anti-inflamatorias. El primer objetivo de la tesis doctoral fue abordar la infección de heridas con compuestos naturales derivados de plantas. Para esto, se estudiaron las propiedades y los mecanismos de acción de diferentes compuestos en bacterias planctónicas utilizando dos modelos bacterianos, uno Gram-positivo, como S. aureus (ATCC 25923) y otro Gram-negativo, como E. coli-S17. Teniendo en cuenta que la formación de biofilm es un problema en las infecciones de heridas, se estudió el efecto de los compuestos naturales en un modelo de biofilm de S. aureus. El carácter volátil de los EOs y la posibilidad de oxidarse cuando están en contacto con luz ultravioleta o el aire, hacen difícil su aplicación. La encapsulación de estos compuestos ayuda a proteger sus propiedades y facilitar así su aplicación final. Así, el timol (THY) demostró ser el compuesto con mejor actividad antimicrobiana en ambos modelos bacterianos, de modo que fue encapsulado en nanofibras de PCL. La síntesis de nanofibras y la encapsulación del THY se llevaron a cabo mediante la técnica de electrospinning. Este método permite la fabricación de nanofibras con encapsulación de compuestos volátiles, como el THY, gracias a la rápida formación de las fibras. Las propiedades bactericidas de los apósitos de PCL cargado con THY se estudiaron utilizando un modelo de S. aureus que expresaba GFP y así poder realizar ensayos cuantitativos y mediante microscopía confocal. El segundo objetivo de la tesis ha sido encontrar un compuesto natural anti-inflamatorio para el tratamiento de heridas. Para ello, se ha optimizado un modelo inflamatorio in vitro en macrófagos J774 activados con lipopolisacárido (LPS). Estos experimentos se llevaron a cabo en el Methodist Hospital Research Institute en Houston (Texas, US), donde se determinaron los niveles de citoquinas inflamatorias lo que nos permitió determinar entre los testados los mejores compuestos naturales anti-inflamatorios. Además, las membranas de PCL-THY demostraron ser los mejores apósitos reduciendo la inflamación, entre los distintos tratamientos de estudio. Tras concluir que el THY encapsulado en nanofibras de PCL mantiene las propiedades antimicrobianas y anti-inflamatorias, se desarrolló un modelo in vivo para determinar la efectividad de los apósitos en heridas de piel infectadas. Para ello, se utilizaron ratones sin pelo SKH1 para analizar las propiedades bactericidas e inflamatorias para su potencial aplicación clínica. El documento está estructurado en diferentes capítulos que abordan cada uno de los objetivos de la tesis doctoral: o El Capítulo I corresponde con la parte introductoria, donde se explican los conceptos generales. El capítulo incluye una descripción del proceso de curación de una herida, resaltando factores que afectan al mismo, como por ejemplo la infección e inflamación. Se explican también los diferentes tipos de tratamientos que existen, como los antibióticos, poniendo especial atención en el desarrollo de resistencias bacterianas a los mismos, como la razón principal de elección de compuestos naturales para el tratamiento de heridas. La técnica de electrospinning se detalla para entender la síntesis de fibras de PCL y la encapsulación de los principios activos. o El Capítulo II se centra en la actividad antimicrobiana de los compuestos libres para abordar la infección de heridas. Se calculó la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) y la Concentración Mínima Bactericida (MBC) de diferentes compuestos derivados de plantas en una cepa de S. aureus (ATCC 25923) y otra de E. coli-S17. Además, se desarrolló un modelo de biofilm en S. aureus para determinar el efecto de los compuestos libres en estas estructuras bacterianas. El mecanismo de acción de los aceites esenciales en las bacterias fue estudiado mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y citometría de flujo. Por último, se estudió la citotoxicidad de los compuestos en tres tipos celulares relacionados con la piel: fibroblastos, queratinocitos y macrófagos. Carvacrol (CAR), cinamaldehido (CIN) y THY demostraron tener la mayor actividad antimicrobiana en un modelo in vitro de S. aureus y E. coli. a través de la disrupción de la membrana bacteriana. Estos resultados están incluidos en el artículo publicado titulado “Evaluation of the antimicrobial activity and cytotoxicity of different components of natural origin present in essential oils”. García-Salinas, S.; Elizondo-Castillo, H.; Arruebo, M.; Mendoza, G.; Irusta, S. Molecules 2018, 23 (6), 1–18.https://doi.org/10.3390/molecules23061399.o Capítulo III: Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el Capítulo II, el THY fue elegido para ser encapsulado en nanofibras de PCL, dada su capacidad antimicrobiana y su baja citotoxicidad comparada con el resto de los compuestos. Se midió el efecto del PCL-THY en contacto con cGFP-expressing S. aureus en suspensión y en forma de biofilm. Por último, se diseñó un modelo de co-cultivo con cGFP-expressing S. aureus y macrófagos J774 para estudiar el efecto del PCL-THY en células infectadas. Los apósitos de PCL-THY eliminaron el crecimiento bacteriano en un modelo de infección de macrófagos J774. Además, los estudios corroboraron la inhibición de la formación de biofilm. Los resultados están incluidos en el artículo titulado “Antimicrobial Wound Dressings Against Fluorescent and Methicillin-Sensitive Intracellular Pathogenic Bacteria” Garcia-Salinas, S.; Gamez-Herrera, E.; Landa, G.; Arruebo, M.; Irusta, S.; Mendoza, G. enviado para su publicación a ACS Applied Materials & Interfaces. Manuscript ID: am-2020-05668q.o El Capítulo IV describe la actividad anti-inflamatoria de los aceites esenciales con el objetivo de reducir y controlar el proceso inflamatorio en la curación de heridas. La abundante inflamación puede causar la activación de células o citoquinas innecesarias que generan efectos deletéreos y retrasan el proceso de curación. Por esta razón, se optimizó un modelo inflamatorio con macrófagos J774 activados con LPS y se estudió el efecto de diferentes compuestos naturales reportados como anti-inflamatorios. Los macrófagos infectados se trataron y se analizaron a nivel genético, midiendo los niveles de expresión de Il (Interleucina) 1b, iNos (óxido nítrico sintasa inducible) e Il10 por RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction). Los aceites esenciales con mejor resultado se encapsularon en nanofibras de PCL y se estudió el efecto de los mismos, confirmando los resultados previamente obtenidos. Además, se realizaron experimentos en los que se evaluó la morfología celular, comparando las células tratadas con controles positivos (células activadas con LPS sin tratamiento) y negativos (células no activadas con LPS). Este experimento demostró la similitud entre las células tratadas y las no activadas, confirmando los efectos anti-inflamatorios del tratamiento. Los resultados están incluidos en el artículo publicado titulado “Electrospun Anti-Inflammatory Patch Loaded with Essential Oils for Wound Healing”. García-Salinas, S.; Evangelopoulos, M.; Gámez-Herrera, E.; Arruebo, M.; Irusta, S.; Taraballi, F.; Mendoza, G.; Tasciotti, E. Int. J. Pharm.2020, 577 (January), 119067. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119067o El Capítulo V unifica toda la investigación realizada durante la tesis en un modelo in vivo de infección de heridas con S. aureus (ATCC 25923) en ratones sin pelo SKH1. Se analizaron las propiedades bactericidas y antiinflamatorias de los apósitos diseñados. Además, se realizaron controles del compuesto libre y de clorhexidina (compuesto utilizado en la clínica) para conocer las ventajas de nuestros apósitos frente a otros tratamientos. En cuanto al control de la infección, se realizaron medidas cuantitativas y cualitativas de las bacterias presentes en la herida a diferentes tiempos post-infección. En cuanto al control de la inflamación, se realizaron análisis histológicos de las heridas evaluando la reacción de células inflamatorias y la formación de nuevos vasos sanguíneos. Los estudios demostraron que los apósitos de PCL-THY pueden prevenir la infección, además de promover la regeneración en heridas. Los resultados están incluidos en el artículo titulado “Efficiency of Antimicrobial Electrospun Thymol-Loaded Polycaprolactone Mats in vivo” Garcia-Salinas, S.; Gamez-Herrera, E.; Asin, J.; de Miguel, R.; Andreu, V.; Sancho-Albero, M.; Mendoza, G.; Irusta, S.; Arruebo, M.: aceptado para su publicación en ACS Applied Biomaterials. Manuscript ID: mt-2020-002706.o El Capítulo VI resume las principales conclusiones obtenidas en este trabajo. o El Apéndice I describe las técnicas de caracterización y métodos biológicos utilizados para evaluar la actividad antimicrobiana y anti-inflamatoria de los compuestos libres y encapsulados. o El Apéndice II indica las referencias utilizadas en este trabajo o El Apéndice III señala los artículos publicados y la participación en congresos que se han llevado a cabo durante la tesis The current Doctoral Thesis, named “Smart dressings based on nanostructured fibers containing natural origin antimicrobial and anti-inflammatory compounds” has been developed in the Department of Chemical Engineering and Environmental Technology (University of Zaragoza, Spain) in the group of Nanostructured Films and Particles (NFP), which is a member of the Aragon Institute of Nanoscience (INA). This research has been developed in this institute and also in the Biomedical Research Center of Aragon (CIBA). A predoctoral stay of 6 months was performed in the Methodist Hospital Research Institute in Houston (Texas, US) supervised by Professor Ennio Tasciotti. This research was supported by a FPI predoctoral fellowship, funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (CTQ2014-52384-R). The short stay was also funded by the Network of Biomedical Research Center in the field of Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN). Due to the development of bacterial resistances, the search of new compounds to treat infections is in the spotlight of researchers. In this scenario, this thesis is focused on the design of a bioactive dressing based on electrospun polycaprolactone (PCL) nanofibers loading natural compounds obtained from essential oils (EOs) acting as anti-inflammatory and antimicrobial compounds for wound healing treatment. For this aim, a deep research on the bactericidal and anti-inflammatory EOs compounds properties was carried out. The first purpose of the thesis was to tackle wound infection with plant-derived natural compounds. For this goal, the bactericidal properties and mechanisms of different free EOs in planktonic bacteria cultures using a Gram-positive strain, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and a Gram-negative strain, Escherichia coli S17 were studied. In addition, since biofilm formation is a challenge in wound infections, the effect of natural compounds was studied on S. aureus biofilm. The high volatility character of EOs and the fact that they can be oxidized in contact with air or ultraviolet light, make difficult their application. Encapsulation of EOs is a good technique to protect their properties. Thus, thymol (THY), the compound that demonstrated the best antimicrobial activity against planktonic bacteria and biofilm, was encapsulated into PCL nanofibers. Nanofibers synthesis and THY encapsulation were carried out using the electrospinning technique. This method allows the fabrication of patches with high load of those volatile compounds such as THY. The bactericidal properties of these patches were studied using a cGFP-expressing S. aureus strain through quantitative assays and confocal microscopy. In order to use these natural compounds for wound healing applications, free-compound cytotoxicity assays were carried out in three different cell types: fibroblast, keratinocytes and macrophages. Moreover, a co-culture model using J774 macrophages and cGFP-expressing S. aureus was developed to study and monitoring the effect of THY loaded PCL patches in intracellular bacteria. The second goal in the thesis was to find an anti-inflammatory natural compound effective for wound treatment. For these assays, an in vitro inflammatory model was optimized in lipopolysaccharide (LPS) -activated J774 macrophages. These experiments were developed in the Methodist Hospital Research Institute in Houston (Texas, US). The study of the increase or reduction levels of inflammatory cytokines allowed us to determine the best anti-inflammatory natural compounds evaluated in our studies. Among them, PCL-THY patches demonstrated to be the wound dressings that better reduced inflammation in an in vitro inflammatory model. After concluding that THY had superior antimicrobial and anti-inflammatory properties when loaded in PCL nanofibers, an in vivo experiment to determine the effectiveness of the designed patches in an infected skin wound model was developed. SKH1 hairless mice were used to analyze the in vivo bactericidal and anti-inflammatory properties of PCL-THY patches for their potential clinical application. The document is structured in different chapters that address each of the goals of this doctoral thesis: Chapter I corresponds with the introductory part where general concepts are exposed. The chapter includes a description of the wound healing processes, pointing the factors affecting the procedure such as infection and inflammation. Different types of wound healing treatments such as antibiotics are described, highlighting antibiotic resistance as the reason to choose plant-derived compounds as a wound healing treatment. Electrospinning technique is explained to understand the synthesis of PCL nanofibers and the encapsulation of the active principle. Chapter II focuses on antimicrobial activity of free EOs to tackle wound infection. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) were measured for different plant-derived natural compounds in S. aureus (ATCC 25923) and E. coli S17 strains. In addition, a S. aureus biofilm model was optimized to determine the effect of EOs in these bacterial formations. The mechanism of action of EOs against bacteria was studied by scanning electron microscopy (SEM) and flow cytometry. Cytotoxicity of EOs treatment was also evaluated in skin-related cell types such as fibroblasts, keratinocytes and macrophages. Carvacrol (CAR), cinnamaldehyde (CIN) and THY exhibited the highest in vitro antimicrobial activities against E. coli and S. aureus by disrupting the bacteria membrane. These results are included in the published article entitled “Evaluation of the antimicrobial activity and cytotoxicity of different components of natural origin present in essential oils”. García-Salinas, S.; Elizondo-Castillo, H.; Arruebo, M.; Mendoza, G.; Irusta, S. Molecules 2018, 23 (6), 1–18. https://doi.org/10.3390/molecules23061399. Chapter III considering the results obtained in Chapter II, THY was chosen as the compound to be loaded into electrospun PCL nanofibers due to its antimicrobial activity and low cytotoxicity compared with the other EOs tested. PCL-THY patches were synthetized, and their bactericidal properties were measured against both, planktonic culture and biofilm of cGFP-expressing S. aureus. A co-culture model using cGFP-expressing S. aureus and J774 macrophages was developed to study the effect of PCL-THY patches on infected cells. Compared to non-loaded dressings, PCL-THY dressings were able to eliminate the pathogenic bacteria in coculture models using infected murine macrophages. In addition, it was corroborated the successful ability of the developed patch in preventing biofilm formation. These results are included in the recently submitted article entitled “Antimicrobial Wound Dressings Against Fluorescent and Methicillin-Sensitive Intracellular Pathogenic Bacteria” Garcia-Salinas, S.; Gamez-Herrera, E.; Landa, G.; Arruebo, M.; Irusta, S.; Mendoza, G. ACS Applied Materials & Interfaces Manuscript ID: am-2020-05668q. Chapter IV describes the anti-inflammatory activity of EOs with the aim of reducing and controlling the inflammatory process during wound healing. Excessive inflammation can cause the activation of unnecessary cells or cytokines, generating deleterious effects, limiting healing. To develop this goal, an inflammatory model of J774 macrophages activated with LPS was carried out. Different free natural compounds reported as anti-inflammatory molecules were assessed. Thus, infected macrophages were treated and analyzed at the genetic level, measuring interleukin (Il) 1b, iNos (inducible Nitric oxide synthase) and Il10 cytokines by RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). PCL patches loaded with EOs were tested using the same in vitro model, confirming previous results. In addition, it was assessed cell morphology and average cell area comparing treated cells with positive (LPS-activated cells without treatment) and negative (non LPS-activated cells) controls. This experiment demonstrated the similarity among treated cells and non-activated cells, confirming the anti-inflammatory effect of THY loaded PCL patches. These results are included in the published article entitled “Electrospun Anti-Inflammatory Patch Loaded with Essential Oils for Wound Healing”. García-Salinas, S.; Evangelopoulos, M.; Gámez-Herrera, E.; Arruebo, M.; Irusta, S.; Taraballi, F.; Mendoza, G.; Tasciotti, E. Int. J. Pharm. 2020, 577 (January), 119067. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119067. Chapter V joins all the research performed during the thesis related to an S. aureus (ATCC 25923) infected wound in vivo model using SHK1 hairless mice. Thus, it was analyzed the in vivo bactericidal and inflammatory properties of the designed dressings. In addition, controls of free EO and a clinical compound (chlorhexidine) were added to assess the advantages of our patch against other treatments. Starting by infection, quantitative and qualitative measurements of bacteria present in the wound were collected at different dpi (days post infection). Moreover, the histological analysis of skin wounds was carried out to evaluate the inflammatory reaction and new vessel formation. Studies demonstrated that PCL-THY can prevent infection, promote wound healing and prompt regeneration. These results are included in the recently accepted article entitled “Efficiency of Antimicrobial Electrospun Thymol-Loaded Polycaprolactone Mats in vivo” Garcia-Salinas, S.; Gamez-Herrera, E.; Asin, J.; de Miguel, R.; Andreu, V.; Sancho-Albero, M.; Mendoza, G.; Irusta, S.; Arruebo, M. ACS Applied Biomaterials. ACS Appl. Bio Mater. 2020, 3 (5), 3430–3439. https://doi.org/10.1021/acsabm.0c00419 Chapter VI summarizes the main conclusions obtained during this doctoral thesis. Appendix I describes the main characterization techniques and biological methods in order to evaluate the antimicrobial and anti-inflammatory ability of free and loaded compounds. Appendix II compiles the references used to write this work. Appendix III points out the published scientific papers and the participation in conferences during this thesis.<br /

    Le numérique en classe de FLE : une practique innovante

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    Cette communication présente l’introduction du numérique en parallèle et en complément des Cours de Français Général (CFG) à l’Université Nationale de Rio Cuarto (UNRC). Il s’agit d’un cours présentiel amélioré, une formation hybride comportant des rencontres et des projections diverses à distance qui mettent à la disposition des étudiants un certain nombre de ressources authentiques de la langue cible, postées sur un groupe fermé de Facebook. La modalité de travail adoptée renforce la démarche actionnelle, constitue un appui solide pour soutenir la motivation des apprenants, fait le lien entre la classe et leurs pratiques à l’extérieur du cours, tout en développant leur potentiel linguistique pour atteindre une communication réussie, des savoir-faire et des savoir-être. Le suivi en présentiel de cette formation est conçu selon une approche de formation/action, participative et interactive, alternant les séances d'analyse pratique, de réflexion théorique et les ateliers d'application.Fil: Bertolo, Silvia Cristina. Universidad Nacional de Río CuartoFil: Irusta, Cecilia Cristina. Universidad Nacional de Río CuartoFil: Morandi, Liliana Mabel. Universidad Nacional de Río Cuart

    Nanofibrous membranes obtained by electrospinning for bone tissue engineering and wound dressing applications

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    Esta tesis doctoral se ha realizado dentro del marco de un acuerdo de co-tutela entre la Universidad de Zaragoza (Universidad de origen), la Universidad de Calabria (Universidad anfitriona) y la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad NOVA de Lisboa (FCT NOVA) (Universidad anfitriona). El trabajo de investigación se ha llevado a cabo dentro del programa de Doctorado en Ingeniería de Membranas Erasmus Mundus (EUDIME), (FPA 2011-0014), financiado por la Unión Europea. La tesis se centró principalmente en el uso de la técnica de electrohilado para producir diferentes tipos de membranas que puedan ser utilizadas en distintas aplicaciones biomédicas. Se sintetizaron y produjeron nanopartículas orgánicas e inorgánicas para ser utilizadas como rellenos o como portadores (sistema de administración de fármacos), así como membranas nanofibrosas electrohiladas. Este trabajo se llevó a cabo en el Instituto de Nanociencia de Aragón (INA), específicamente en el grupo de Nanostructured Films and Particles (NFP) bajo la supervisión de la profesora Silvia Irusta y la Dra. Gracia Mendoza. Una parte importante de la caracterización físico-química se realizó en el INA. En la Universidad de Calabria se trabajó bajo la supervisión de la Dra. Loredana de Bartolo en el Instituto de Tecnología de Membranas (ITM). Allí se utilizaron técnicas específicas tanto para la caracterización como para estudiar diferentes señales biológicas producidas por las membranas sintetizadas, bajo la supervisión. Por otro lado, la movilidad llevada a cabo en la Facultad de Ciencias y Tecnología (FCT NOVA) de la Universidade NOVA (FCT NOVA) bajo la supervisión de la profesora Ana Isabel Aguiar-Ricardo, permitió realizar una caracterización completa de dos membranas asimétricas siguiendo diferentes Normas Internacionales que establecen diferentes ensayos a realizar en apósitos primarios utilizados en heridas. El desarrollo de nuevos scaffolds cargados con proteínas morfogenéticas o antibióticos es de gran interés en el campo de la ingeniería de tejidos óseos. Scaffolds electrohilados con una microporosidad mejorada puede ser beneficioso para mejorar la viabilidad celular debido a que una alta porosidad junto a la presencia de microporos puede proporcionar un entorno tridimensional (3D) que no solamente facilita la siembra y difusión celular sino también proporciona una mejor difusión de los nutrientes y residuos a través del scaffolds. La adición de cerámica de fosfato de calcio ha sido ampliamente investigada para fabricar scaffolds altamente porosos para la ingeniería de tejidos óseos debido a que presentan una composición muy similar al hueso, incluyendo excelentes propiedades de biocompatibilidad, osteoinductivas y osteoconductoras. Partículas cargadas con proteínas morfogenéticas de hueso distribuidas homogéneamente en el scaffolds podrían asegurar una liberación continua del factor de crecimiento proporcionando de esta forma las señales bioquímicas necesarias para la reparación y regeneración ósea. Los scaffolds cargados con antibióticos pueden proporcionar una liberación sostenida del fármaco en el sitio de interés, así como el mantenimiento de propiedades osteogénicas mejoradas para la regeneración exitosa del hueso. Evitando de esta forma que se alcancen niveles de toxicidad o niveles ineficaces en la zona de interés, así como la aparición de efectos secundarios indeseados en los pacientes que provocan un rechazo a los tratamientos prolongados de fármacos por vía sistemática (vía oral e intravenosa). Otra aplicación biomédica interesante de las membranas electrohiladas es la fabricación de apósitos inteligentes eficientes para el tratamiento de heridas. Para lograr una curación rápida de la herida es necesario desarrollar membranas apropiadas con poros interconectados capaces de prevenir la deshidratación rápida y la penetración de bacterias. Para mantener un ambiente húmedo en el lecho de la herida se necesita una alta capacidad de absorción y una adecuada transmisión de vapor de agua. Además, si la membrana electrohilada presenta propiedades bactericidas facilitará el proceso de curación. El objetivo principal de esta tesis fue el desarrollo mediante electrohilado de membranas fibrosas con las características apropiadas para ser utilizadas en la ingeniería de tejidos óseos o como apósito para heridas. En los Capítulos II al V se plantean una serie de objetivos específicos con el fin de cumplir el objetivo principal. Este documento de tesis se dividió en las siguientes secciones: CAPÍTULO I, corresponde a la introducción general donde se describen los conceptos de biomateriales, scaffolds, ingeniería de tejidos y el objetivo principal de los sistemas de liberación de fármacos. Así como, la clasificación de los biomateriales y la ingeniería de tejidos según el origen de los materiales. Además se ponen de manifiesto todos los factores que deben tenerse en cuenta para desarrollar y aplicar adecuadamente los apósitos para heridas. Se mencionaron las diferentes técnicas utilizadas en la literatura haciendo énfasis en el uso de electrohilado y electropulverización para producir scaffolds o membranas para su uso en la ingeniería del tejido óseo y como apósitos para heridas. CAPÍTULO II, se enfoca en el desarrollo y mejora de andamios 3D capaces de promover una eficiente regeneración ósea junto con la liberación de antibióticos dirigidos para prevenir la colonización de bacterias. El objetivo de este trabajo fue sintetizar y caracterizar un sistema de liberación de fármacos que consiste en nanofibras electrohiladas de policaprolactona (PCL) decoradas con partículas de poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) cargadas con rifampicina (RFP). Este material debe promover la reparación ósea evitando el deterioro del scaffolds provocado por una infección. Se realizó la evaluación in vitro de la capacidad bactericida del material electrohilado sintetizado contra bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Escherichia coli), así como su citocompatibilidad en cultivos 3D con osteoblastos humanos. Estos resultados se enviaron a la Revista de farmacia “International Journal of Pharmaceuitics” para su publicación en formato de artículo y está bajo revisión. CAPÍTULO III, se describe la síntesis y caracterización de membranas con estructura de núcleo-envoltura de PCL y acetato de polivinilo (PVAc) obtenidas por electrohilado. Las fibras se cargaron con nanopartículas de hidroxiapatita sintética (HAn) para aumentar la bioactividad de los materiales. Los scaffolds desarrollados se trataron con ablación láser para crear características topográficas deseadas a nivel micrométrico con el objetivo de favorecer la adhesión y crecimiento celular. Todas las membranas obtenidas presentaron una estructura de poros tridimensionalmente interconectados y el tratamiento con láser provocó un aumento en la viabilidad y densidad celular. Además, el aumento en la biocompatibilidad de los scaffolds sugiere que los microporos pequeños favorecen la adhesión y proliferación celular. Estos resultados fueron publicados en el artículo titulado “Laser-treated electrospun fibers loaded with nano-hydroxyapatite for bone tissue engineering”. Javier Aragon, Nuria Navascues, Gracia Mendoza, Silvia Irusta. International Journal of Pharmaceutics 525,112–122, 2017. DOI:10.1016/j.ijpharm.2017.04.022. CAPÍTULO IV, se refiere al desarrollo de un scaffold electrohilado compuesto por fibras con estructura de núcleo-cubierta de PCL o PCL/PVAc cargado con HAn sintética. Estas fibras se decoraron con partículas de PLGA cargadas con proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) mediante el uso simultaneo de electrohilado coaxial y electropulverización. El objetivo de este trabajo fue evaluar las propiedades estructurales y físico-químicas así como el proceso de biodegradación de los nuevos scaffolds desarrollados y su capacidad para abordar las características arquitectónicas, bioquímicas y funcionales del tejido óseo. Para esto, se probó la bioactividad del scaffold mediante el cultivo de osteoblastos humanos sobre ellos y se monitoreo de la viabilidad celular durante 4 semanas. Se evaluó la actividad osteogénica in vitro de las células sembradas sobre los scaffolds determinando la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y la expresión de osteocalcina (OCN) y osteopontina (OPN) como proteínas osteogénicas. Estos resultados fueron publicados en el artículo titulado “Polymeric electrospun scaffolds for bone morphogenetic protein 2 delivery in bone tissue engineering”. Javier Aragón, Simona Salerno, Loredana De Bartolo, Silvia Irusta and Gracia Mendoza. Journal of Colloid and Interface Science, 531 (2018) 126–137. DOI:10.1016/j.jcis.2018.07.029. El CAPÍTULO V, describe la síntesis de un apósito antimicrobiano para heridas, con una resistencia mecánica adecuada que es capaz de absorber exudados y evitar la deshidratación rápida de una herida. Se prepararon membranas asimétricas de PCL/PVAc cargadas con carvacrol (CRV) mediante el uso simultáneo de electrohilado y electropulverización. Las membranas constan de dos capas; la primera es una capa de PCL electrohilado; la segunda, una lámina de PVAc que estaría en contacto con la piel liberando a su vez el compuesto antimicrobiano. Se demostró que el uso de diferentes disolventes pueden dar lugar a la obtención de diferentes morfologías de la capa PVAc-CRV. Los valores obtenidos de elongación máxima de las membranas antes de romperse son adecuados para ser utilizados como apósitos para heridas ya que están en el mismo rango reportado de elongaciones en la piel humana. Las membranas presentan una tasa óptima de Transmisión de vapor de agua (WVTR) con valores que se encuentran en el rango requerido para mantener un buen balance entre humedad y pérdida de agua en la herida. En la primera semana, se liberó más del 60 % del CRV cargado, mientras que después de tres semanas, las membranas liberaron entre el 85 y el 100 % del CRV cargado mediante la contribución de un proceso de difusión de tipo Fickiano y la relajación delas cadenas poliméricas. Las membranas sintetizadas son candidatas potenciales para ser utilizadas como apósitos para heridas. El manuscrito que resume estos resultados se envió a la revista “Materials Science and Engineering C” y está bajo revisión (MSEC_2018_3013). CAPÍTULO VI, resume las conclusiones generales del trabajo de tesis. APÉNDICE 1, describe las principales técnicas de caracterización y los métodos para evaluar diferentes propiedades en función de las posibles aplicaciones. APÉNDICE 2, resume los artículos publicados y la participación en foros científicos durante el período de tesis. 1The current Doctoral Thesis work has been performed under a co-supervision agreement between University of Zaragoza (Home University), University of Calabria (Host University) and Faculty of Sciences and Technology of the NOVA University of Lisbon (FCT NOVA) (Host University). This research has been carried out inside the Erasmus Mundus Doctorate in Membrane Engineering program (EUDIME), (FPA 2011-0014), funded by the European Union. This thesis focused mainly on the use of the electrospinning technique to produce different kind of membranes for biomedical applications. In particular, it described the synthesis and production of inorganic and organic nanoparticles to be used as fillers or as carriers (drug delivery system) as well as the production of electrospun nanofibrous membranes. This work was carried out within the Institute of Nanoscience of Aragon (INA), specifically in the Nanostructured Films and Particles (NFP) group under the supervision of the Professor Silvia Irusta and Dr Gracia Mendoza. Also an important part of the physico-chemical characterization was done at INA.The study of different biological signals and the use of specific techniques for membrane characterization were acquired at the University of Calabria under the supervision of Dr. Loredana De Bartolo in the Institute on Membrane Technology of the National Research Council of Italy (ITM-CNR). On the other hand, the mobility carried out at the Faculty of Sciences and Technology (FCT NOVA) of Universidade NOVA (FCT NOVA) under the supervision of Professor Ana Isabel Aguiar-Ricardo, allowed a total characterization of two asymmetric membranes following different International Standards to accomplish testing for primary wound dressing.The development of novel membranes loaded with morphogenetic proteins or antibiotic are of great interest in the field of bone tissue engineering. To promote the cellular viability and extracellular matrix production, electrospun membranes with enhanced porosity and micro-scale pores could be beneficial since increased porosity and pore size can provide a three-dimensional (3D) environment that not only facilitates cell seeding/diffusion but also provides better diffusion of nutrients and waste throughout the membranes. The addition of calcium phosphate ceramics has been extensively investigated to fabricate highly porous membranes to bone tissue engineering due to their close similar composition of bone, including excellent biocompatibility, osteoinductive and osteoconductive properties. A homogeneous distribution of the bone morphogenetic protein-loaded particles along the entire membrane could be ensuring a continuous release of the growth factor to provide the necessary biochemical cues for bone repair and regeneration.Antibiotic-loaded membranes may provide drug targeted and sustained release, avoiding the long-term oral and intravenous systematic multidrug administration, which implies toxic side effects, low delivery to the target site and low patient adherence to the treatment. Therefore, membranes loaded with antibiotics can overcome the drawbacks of the traditional therapy sustaining enhanced osteogenic properties for the successful regeneration of the bone. Another interesting biomedical application of electrospun membranes is the fabrication of efficient smart dressings for the treatment of wounds. A rapid wound healing requires developing appropriate membranes with interconnected pores that allow the oxygen diffusion and transport of metabolic waste, as well as an adequate pore size to prevent rapid dehydration and bacteria penetration. A high absorption capacity and adequate water vapor transmission will be necessary to keep a moist environment in the wound bed. Besides, if the electrospun membrane has some bactericidal properties will be better for the healing process.The main goal of this thesis was the development of fibrous membranes by electrospinning with the appropriate characteristics to be used in bone tissue engineering or as wound dressing materials. To achieve this target, several specific objectives were defined, which are described in Chapters II to V.The thesis was divided in the following sections: CHAPTER I, is an introduction where the concepts of biomaterials, scaffolds and tissue engineering and the main target of drug delivery systems are described. The chapter includes the classification of biomaterials according to the origin of the materials and tissue engineering is also described as well as all the factors that must be taken into account to develop and properly apply a wound dressing are discussed. Different kind of techniques used in the literature to produce scaffolds or membranes for bone tissue engineering and wound dressings are mentioned, focusing on the use of electrospinning and electrospray to produce them. CHAPTER II, focuses on the development of enhanced 3D membranes able to promote efficient bone regeneration together with targeted antibiotic release to prevent bacteria colonization. The aim of this work was to synthesize and characterize a drug delivery system consisting of polycaprolactone (PCL) electrospun nanofibers decorated with rifampicin (RFP) loaded into poly(lactic-coglicolic acid) (PLGA) particles. This material would promote bone repair avoiding the impairment of the membrane mediated by infection. The bactericidal ability of the synthesized electrospun material was assessed In vitro against gram positive (Staphylococcus aureus) and gram negative (Escherichia coli) bacteria, as well as its cytocompatibility in human osteoblasts 3D cultures. These results are included in the accepted article entitled “Composite scaffold obtained by electro-hydrodynamic technique for infection prevention and treatment in bone repair”. Javier Aragon, Sergio Feoli, Gracia Mendoza, Silvia Irusta. International Journal of Pharmaceutics. CHAPTER III, describes the synthesis and characterization of core-shell membranes of PCL and polyvinyl acetate (PVAc) obtained by electrospinning. The fibers were loaded with synthetic hydroxyapatite nanoparticles (HAn) to increase the bioactivity of the materials. The prepared membranes were then treated by laser ablation to create desired microscale topographical features in order to favor cell adhesion and growth. All prepared membranes exhibited a three-dimensional network structure with interconnected pores; the laser treatment has modified the structural characteristics of the membrane causing an increase the cell viability and cell density. The materials biocompatibility is affected by the structural properties of the membranes, indeed smaller micropore sizes favor cell adhesion and proliferation. These results are published in the article entitled “Laser-treated electrospun fibers loaded with nano-hydroxyapatite for bone tissue engineering”. Javier Aragon, Nuria Navascues, Gracia Mendoza, Silvia Irusta. International Journal of Pharmaceutics 525,112–122, 2017. DOI:10.1016/j.ijpharm.2017.04.022. CHAPTER IV, refers to the development of a composite electrospun membrane of PCL or PCL/PVAc core–shell fibers loaded with synthetic HAn. These fibers were decorated with bone morphogenetic protein 2 (BMP2) loaded in/into PLGA particles via simultaneous electrospraying and coaxial electrospinning. The aim of this study was to evaluate the structural and physico-chemical properties and biodegradation processes of the newly developed membranes assessing their ability to address the architectural, biochemical, and functional features of bone tissue. For this purpose, the membrane bioactivity was tested by culturing human osteoblasts on the membranes and by monitoring cell viability up to 4 weeks. The In vitro osteogenic activity of cells seeded onto the membranes was evaluated by assessing alkaline phosphatase (ALP) activity and the expression of osteogenic proteins osteocalcin (OCN) and osteopontin (OPN). These results are published in the article “Polymeric electrospun scaffolds for bone morphogenetic protein 2 delivery in bone tissue engineering”. Javier Aragón, Simona Salerno, Loredana De Bartolo, Silvia Irusta and Gracia Mendoza. Journal of Colloid and Interface Science, 531 (2018) 126–137. DOI:10.1016/j.jcis.2018.07.029. CHAPTER V, describes the synthesis of an antimicrobial wound dressing material, with appropriate mechanical resistance avoiding rapid dehydration and absorbing exudates. PCL/PVAc asymmetric membranes loaded with carvacrol (CRV) were prepared by electrospinning and electrospraying simultaneously. The membranes consist of two layers: the first is an electrospun PCL sheet, the second a PVAc sheet that would be in contact with the skin releasing the antimicrobial compound. The use of different solvents results in different morphologies for the PVAc-CRV layer. The membranes exhibit mechanical properties with strain to failure values that are in the range of human skin, being adequate to be deposited over a wound surface. The samples present Water Vapor Transmission (WVTR) values in the required range to keep good moisture balance with water loss from the wound at the optimal rate. In the first week, more than 60 % of the loaded CRV was released while after three weeks membranes released between 85 to 100 % of the loaded CRV through a Fickian diffusion and diffusion due to polymer relaxation. The synthesized membranes are potential candidates to be used for wound dressing applications. The manuscript summing up these results has been submitted to a scientific journal and is currently under review. GENERAL CONCLUSIONS, summarizes the conclusions of the thesis work. APPENDIX 1, describes the main characterization techniques and the methods to evaluate different properties according to the possible applications. APPENDIX 2, summarizes the articles published and the participation in scientific forums during the thesis period.<br /

    Nanopartículas cargadas con aceites esenciales para aplicación en apósitos

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    El tratamiento de quemaduras y heridas crónicas que tardan en cicatrizar necesitan del desarrollo de materiales apósitos que presenten una estructura similar a la matriz extracelular y que además liberen sustancias bactericidas, antiinflamatorias y cicatrizantes con una cinética de liberación determinada por las necesidades de cada patología en cada momento. Por otro lado, debido al aumento de las resistencias a antibióticos que está apareciendo en los últimos años, la utilización de aceites esenciales supone una alternativa frente al uso de antibióticos en el desarrollo de nuevos apósitos. Los aceites esenciales son biomoléculas naturales que presentan actividad antimicrobiana, antiinflamatoria, analgésica y cicatrizante, necesaria en materiales para apósitos. Como objetivo se pretendía mejorar la liberación controlada de principios activos mediante su encapsulación en sistemas nanopartículados los cuales preservan la estabilidad del principio activo y permiten su liberación directa sobre la herida aumentando su efectividad. El trabajo constó de dos partes: En la primera parte se llevó a cabo la síntesis de dos tipos de nanopartículas: partículas de PLGA y niosomas. En su interior se quería encapsular la mayor cantidad posible de tres principios activos de aceites esenciales, que fueron el Carvacrol, el Timol y el Cinamaldehído. Se realizó un estudio de la máxima cantidad de principio activo que era posible encapsular tanto en los niosomas como en las nanopartículas de PLGA. Ambos sistemas nanoparticulados junto con el principio activo encapsulado fueron perfectamente caracterizados físico-químicamente utilizando las distintas técnicas disponibles: Espectrometría de masas para conocer su composición; Dispersión Dinámica de la luz (DLS) para determinar el radio hidrodinámico; Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) y Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) para analizar morfología y tamaño. Una vez logrado un diseño óptimo de la encapsulación de los aceites, en la segunda parte del trabajo se procedió al estudio de la capacidad bactericida de las nanopartículas cargadas sobre la bacteria Escherichia coli. Para ello se realizaron ensayos microbiológicos que permitieron obtener la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la concentración mínima bactericida (MBC)

    Antimicrobial Wound Dressings against Fluorescent and Methicillin-Sensitive Intracellular Pathogenic Bacteria

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    There is limited evidence indicating that drug-eluting dressings are clinically more effective than simple conventional dressings. To shed light on this concern, we have performed evidence-based research to evaluate the antimicrobial action of thymol (THY)-loaded antimicrobial dressings having antibiofilm forming ability, able to eradicate intracellular and extracellular pathogenic bacteria. We have used four different Staphylococcus aureus strains, including the ATCC 25923 strain, the Newman strain (methicillin-sensitive strain, MSSA) expressing the coral green fluorescent protein from the vector pCN47, and two clinical reference strains, Newman-(MSSA) and USA300-(methicillin-resistant strain), as traceable models of pathogenic bacteria commonly infecting skin and soft tissues. Compared to non-loaded dressings, THY-loaded polycaprolactone-based electrospun dressings were also able to eliminate pathogenic bacteria in coculture models based on infected murine macrophages. In addition, by using confocal microscopy and the conventional microdilution plating method, we corroborated the successful ability of THY in preventing also biofilm formation. Herein, we demonstrated that the use of wound dressings loaded with the natural monoterpenoid phenol derivative THY are able to eliminate biofilm formation and intracellular methicillin-sensitive S aureus more efficiently than with their corresponding THY-free counterparts
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