Role of wnt/beta-catenin signaling in ovarian tumour growth and angiogenesis. A crosstalk with Notch system

Wnt/β-catenin and Notch are highly conserved pathways that regulate a diversity of cell processes, including proliferation, apoptosis and differentiation. We analyzed the role of both systems in ovarian cancer using specific inhibitors. For this purpose we performed three in vivo experiments. A human ovarian adenocarcinoma cell line (IGROV-1) was subcutaneously injected in 6-8 weeks-old female nude mice. Once the tumours were palpable, we injected the inhibitors: the first and second experiments were carried out using Wnt/β-catenin inhibitors (XAV939: 2.5, 5 mg/kg; ICG-001: 5 and10 mg/kg). The third experiment was a combination of ICG-001 (5mg/kg) and DAPT (5 mg/kg), a Notch inhibitor. Mice were injected every two days three times and they were euthanized 3 days after the last injection. Our results showed a significant decrease in tumour size when mice were treated either with XAV939 or with ICG-001. When compared with tumours from non-treated animals, both experiments showed a significant decrease in cell proliferation (KI67) and a decrease in the endothelial and periendothelial cell area stained with CD31 and α-Smooth-muscle-actin, respectively. When mice were treated with XAV939, a significant decrease in VEGF levels and Angiopoietin 1/2 was observed. Regarding the experiment with the combination of inhibitors, there was a significant decrease in tumour size and a decline in tumour cell proliferation (KI67). Both inhibitors administered simultaneously produced a decrease in cell proliferation at the same extent as individually administrated. In conclusion, we demonstrate a clear involvement of Wnt/β-catenin in ovarian tumour growth and angiognesis. We suggest an interaction of this pathway with Notch system.Fil: Bocchicchio, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaXX Jornadas anuales de la Sociedad Argentina de Biología. XVII Jornadas de la Sociedad Uruguaya de BiocienciasBuenos AiresArgentinaSociedad Argentina de BiologíaSociedad Uruguaya de Biologí

Dynamic expression of epoxyeicosatrienoic acid synthesizing and metabolizing enzymes in the primate corpus luteum

Epoxyeicosatrienoic acids (EpETrEs), produced from arachidonic acid via cytochrome P450 (CYP) epoxygenases, regulate inflammation, angiogenesis, cellular proliferation, ion transport and steroidogenesis. EpETrE actions are regulated through their metabolism to diols (dihydroxyeicosatrienoic acids; DiHETrE) via the enzyme soluble epoxide hydrolase (EPHX2). We set out to determine, therefore, whether EpETrE generating (epoxygenases CYP2C8, 2C9, 2C19, 2J2, 1A2 and 3A4) and metabolizing (EPHX2) enzymes are expressed in the primate corpus luteum (CL). CL were isolated from rhesus macaques during the early (day 3-5 post-LH surge), mid (day 6-8), mid-late (day 10-12), late (day 14-16) and very-late (day 17-19: menses) luteal phase of natural menstrual cycles. EPHX2 mRNA levels peaked in mid-late CL (5-fold when compared with early CL, P<0.05) and remained elevated in the late CL. Ablation of pituitary LH secretion and luteal steroid synthesis significantly reduced (P<0.05) EPHX2 mRNA levels in the mid-late CL, with progestin replacement being insufficient to restore its level of expression to control values. EPHX2 protein was localized to large and small luteal cells, as well as vascular endothelial cells. The EpETrE-generating CYP epoxygenase 2J2, 2C9 and 3A4 genes were also expressed in the macaque CL. While CYP2J2 mRNA levels did not significantly change through the luteal phase, CYP2C9 and CYP3A4 levels were significantly (P<0.05) higher in the mid-late phase when compared with the early phase. CYP2C9, 2J2 and 3A4 proteins were each localized to the large luteal cells, with 2C9 and 2J2 also being present in the small luteal, stromal and endothelial cells. These studies demonstrate for the first time that an EpETrE generating and metabolizing system exists in the primate CL, with the latter being regulated by LH and steroid hormone(s).Fil: Irusta, Griselda. State University of Oregon; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Murphy, M. J.. Oregon Health and Science University; Estados UnidosFil: Perez, W. D.. Oregon Health and Science University; Estados UnidosFil: Hennebold J.D.. Oregon Health and Science University; Estados Unido

PDGFB as a vascular normalization agent in an ovarian cancer model treated with a gamma-secretase inhibitor

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer-related deaths in women. In the past 20 years, the canonical types of drugs used to treat ovarian cancer have not been replaced and the survival rates have not changed. These facts show the clear need to find new therapeutic strategies for this illness. Thus, the aim of the present study was to investigate the effect of a gamma-secretase inhibitor (DAPT) in combination with the Platelet-derived growth factor B (PDGFB) on an ovarian cancer xenograft model. To achieve this goal, we analyzed the effect of the administration of DAPT alone and the co-administration of DAPT and recombinant PDGFB on parameters associated with tumour growth and angiogenesis in an orthotopic experimental model of ovarian cancer. We observed that the dose of DAPT used was ineffective to reduce ovarian tumour growth, but showed anticancer activity when co-administered with recombinant PDGFB. The administration of PDGFB alone normalized tumour vasculature by increasing periendothelial coverage and vascular functionality. Interestingly, this effect exerted by PDGFB was also observed in the presence of DAPT. Our findings suggest that PDGFB is able to improve tumor vascularity and allows the anticancer action of DAPT in the tumor. We propose that this therapeutic strategy could be a new tool for ovarian cancer treatment and deserves further studies.Fil: Pazos Maidana, María Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sequeira, Gonzalo Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Bocchicchio, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: May, Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Farmacológicas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Investigaciones Farmacológicas; ArgentinaFil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Effects of an inhibitor of the gamma-secretase complex on proliferation and apoptotic parameters in a FOXL2-mutated granulosa tumor cell line (KGN).

Ovarian granulosa cell tumors (GCTs) represent 3%-5% of all ovarian malignancies. Treatments have limited proven efficacy and biologically targeted treatment is lacking. The aim of this study was to investigate the role of Notch signaling in the proliferation, steroidogenesis, apoptosis, and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT pathway in a FOXL2-mutated granulosa tumor cell line (KGN) representative of the adult form of GCTs. When Notch signaling is initiated, the receptors expose a cleavage site in the extracellular domain to the metalloproteinase TACE and, following this cleavage, Notch undergoes another cleavage mediated by the presenilin-gamma-secretase complex. To achieve our goal, DAPT, an inhibitor of the gamma-secretase complex, was used to investigate the role of the Notch system in parameters associated with cell growth and death, using a human granulosa cell tumor line (KGN) as an experimental model. We observed that JAGGED1, DLL4, NOTCH1, and NOTCH4 were highly expressed in KGN cells as compared to granulosa-lutein cells obtained from assisted reproductive techniques patients. The proliferation and viability of KGN cells, as well as progesterone and estradiol production, decreased in the presence of 20 μM DAPT. Apoptotic parameters like PARP and caspase 8 cleavages, BAX, and BCLXs increased in KGN cells cultured with DAPT, whereas others such as BCL2, BCLXl, FAS, and FAS ligand did not change. AKT phosphorylation decreased and PTEN protein increased when Notch signaling was inhibited in KGN cells. We conclude that the Notch system acts as a survival pathway in KGN cells, and might be interacting with the PI3K/AKT pathway.Fil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Pazos Maidana, María Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: de Zúñiga, Ignacio Javier. Centro Médico PREGNA Medicina Reproductiva; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentin

Experimental techniques for the study of angiogenesis in female reproductive diseases

El desarrollo vascular en el tracto reproductivo femenino es un proceso que se encuentra restringido a la formación del cuerpo lúteo y a la proliferación del endometrio uterino durante los ciclos menstruales. Se han identificado numerosos inductores de la angiogé- nesis, que incluyen, entre otros, los miembros del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y la familia del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), angiopoyetinas (ANGPT), factor de crecimiento transformante (TGF) y factor derivado de plaquetas (PDGF). Los defectos en la angiogénesis ovárica contribuyen a una variedad de desórdenes, incluyendo anovulación e infertilidad, pérdida de embarazo, síndrome de hiperestimulación ovárica (SHEO), síndrome de ovario poliquístico (SOP) y neoplasmas ováricos. Es decir, el endotelio es una fuente y un blanco de sustancias vasoactivas que son secretadas debido a las condiciones que se desencadenan durante los desórdenes ya mencionados. Para evaluar los mecanismos bioquímicos y moleculares que participan en la angiogénesis, se han desarrollado métodos in vitro (migración por herida, tubulogénesis, etc.) e in vivo (implante de Matrigel, membrana corionalantoide, etc.). Los ensayos in vitro pueden ser útiles para validar los primeros pasos de la angiogénesis pero deben ser confirmados por estudios in vivo. En particular, los ensayos in vitro e in vivo descriptos en este trabajo para evaluar el desarrollo de los vasos pueden ser aplicados para el estudio de desórdenes reproductivos con alteraciones en la angiogénesis (SHEO, SOP, cáncer de ovario, etc.) mediante la utilización del suero, líquido peritoneal, fluido folicular o de biopsias de distintos tejidos provenientes de las pacientesFil: Scotti, Leopoldina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Pazos Maidana, María Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Pascuali, Natalia Marisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Haro Durand, Luis Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentin

Mechanisms involved in ovarian follicular atresia: relationship between steroidogenesis, angiogenesis and apoptosis

En este trabajo se han realizado experimentos para dilucidar la función local en el ovario de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH-I). Se han estudiado procesos fundamentales del desarrollo folicular como la síntesis de esteroides sexuales y la angiogénesis ovárica en su relación con la apoptosis folicular. En nuestro laboratorio se postuló que el GnRH-I ejerce una acción inhibitoria durante el desarrollo folicular actuando como modulador intraovárico. En ratas estimuladas con gonadotrofinas analizamos los niveles de esteroides sexuales y la expresión y contenido de enzimas ováricas responsables de la síntesis de esteroides luego del tratamiento con un agonista de GnRH-I, Acetato de Leuprolide (LA). Los efectos observados se han corroborado con experimentos realizados in vitro utilizando este mismo agonista. Además, estudiamos factores angiogénicos esenciales para el desarrollo y establecimiento de la vasculatura en el folículo ovárico, como también parámetros de la atresia folicular. El tratamiento con el agonista afectó la síntesis de esteroides ováricos al igual que el contenido folicular de las enzimas esteroidogénicas, produciendo una disminución en la síntesis de andrógenos y como consecuencia, en la producción de estradiol. Estos resultados se observaron en los experimentos realizados in vivo e in vitro. También se observó una disminución en el contenido de factores angiogénicos y de sus receptores, acompañado de un aumento de la actividad de caspasa-3, enzima efectora clave en el proceso de apoptosis folicular. Se concluyó que el factor GnRH-I actuaría en el ovario localmente afectando factores esenciales para el desarrollo folicular. Este factor interfiere en la foliculogénesis inducida por gonadotrofinas, alterando la síntesis de esteroides gonadales e inhibiendo la angiogénesis folicular. Esto alteraría el balance de los factores de supervivencia de las células foliculares, causando la activación de proteínas reguladoras de la apoptosis, llevando a los folículos en desarrollo al proceso de atresia.In the present work, we have performed experiments to elucidate the local ovarian role of Gonadotropin Releasing Hormone-I (GnRH-I). Main processes of the follicular development were studied as sexual steroids synthesis, angiogenesis and its relationship with the follicular apoptosis. In our laboratory, it was proposed that GnRH-I exerts an inhibitory action of follicular development acting as a local ovarian modulator. In gonadotropin-stimulated rats treated with a GnRH-I agonist, Leuprolide Acetate (LA), we analyzed the sexual steroids levels and the expression and content of steroidogenic enzymes. The in vivo results were compared and corroborated by performing in vitro experiments using the agonist. Moreover, we analyzed essential angiogenic factors for the development and stabilization of the vascular vessels in the ovarian follicle as well as, follicular atresia parameters. The agonist treatment altered the ovarian steroids synthesis and the follicular content of the steroidogenic enzymes, diminishing the androgen synthesis and as a consequence, the estradiol production. These results were observed in in vivo and in vitro experiments. We also observed a decrease in follicular angiogenic factors and their receptors content, and this was parallel to an increase in the activity of caspase-3 enzyme, key effector of the follicular apoptosis process. We concluded that GnRH-I would act locally in the ovary affecting essential factors for follicular development. In addition it interferes in the gonadotropin-induced folliculogenesis, altering gonadal steroids synthesis and inhibiting follicular angiogenesis. This will lead to an imbalance of the survival factors of the follicular cells, causing the activation of apoptotic regulatory proteins and inducing atresia in the developing follicles.Fil:Irusta, Griselda. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival

In the last 40 years ovarian cancer mortality rates have slightly declined and,consequently, it continues to be the fifth cause of cancer death in women. In thepresent study, we showed that β‐catenin signaling is involved in the functions ofovarian cancer cells and interacts with the Notch system. Wnt and Notch systemsshowed to be prosurvival for ovarian cancer cells and their inhibition impaired cellproliferation and migration. We also demonstrated that the inhibition of β‐catenin bymeans of two molecules, XAV939 and ICG‐001, decreased the proliferation of theIGROV1 and SKOV3 ovarian cancer cell lines and that ICG‐001 increased thepercentage of IGROV1 cells undergoing apoptosis. The simultaneous inhibition ofβ‐catenin and Notch signaling, by using the DAPT inhibitor, decreased ovarian cancercell proliferation to the same extent as targeting only the Wnt/β‐catenin pathway. Asimilar effect was observed in IGROV1 cell migration with ICG‐001 and DAPT.ICG‐001 increased the Notch target genes Hes‐1 and Hey‐1 and increased Jagged1expression. However, no changes were observed in Dll4 or Notch 1 and 4expressions. Our results suggest that Notch and β‐catenin signaling co‐operate inovarian cancer to ensure the proliferation and migration of cells and that this couldbe achieved, at least partly, by the upregulation of Notch Jagged1 ligand in theabsence of Wnt signaling. We showed that the Wnt pathway crosstalks with Notch inovarian cancer cell functions, which may have implications in ovarian cancertherapeutics.Fil: Bocchicchio, Sebastián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Foliculogénesis

La foliculogénesis es el proceso de crecimiento del folículo y su pasaje a través de los distintos estadios de desarrollo, desde el momento del cual que emerge de la reserva de folículos formados durante la ovogénesis, hasta que es ovulado o entra en atresia (regresión o muerte del folículo). Antes del nacimiento, las células germinales primordiales u ovogonias cesan su división mitótica y comienzan el proceso de meiosis, quedando arrestados en la profase de la primera división meiótica. En este momento, se denominan ovocitos primarios. Los ovocitos se rodean de una capa única de células foliculares aplanadas llamadas pregranulosa. En esta fase, las superficies del ovocito y de las células foliculares envolventes son lisas y están en estrecho contacto. Las células de la pregranulosa se encuentran envueltas en la llamada lámina basal que separa a este tipo celular de todo elemento que la rodea, incluyendo vasos sanguíneos, capilares y nervios 1 . Estos folículos se denominan folículos primordiales y constituyen la reserva de folículos en reposo, los cuales serán progresivamente eliminados durante la vida reproductiva. Aparecen en el humano en la semana 16 de embarazo y su formación terminaría aproximadamente en la semana sexta luego del nacimiento 2 . Al momento del nacimiento, el ovario humano contiene alrededor de 1.000.000 de folículos. Para que estos folículos primordiales inicien su crecimiento, es necesaria una compleja interacción entre factores estimulatorios e inhibitorios.Fil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Belgrano. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Universidad de Belgrano. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Universidad de Belgrano. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Angiopoietin 1 reduces rat follicular atresia mediated by apoptosis through the PI3K/Akt pathway

The aim of this study was to determine the effect of the local inhibition of ANGPT1 on steroid production, proliferation and apoptosis of ovarian follicular cells and on the PI3K/AKT pathway. We also examined the effect of ANGPTs on follicular cell apoptosis and proliferation in early antral follicles (EAFs) in culture. Follicular cells expressing PCNA decreased after ANGPT1 Ab treatment. Moreover, ANGPT1 inhibition increased the levels of active caspase 3 and androsterone, but decreased estradiol, AKT phosphorylation and the area of smooth muscle cell actin. In cultured EAFs from prepubertal rats treated with diethylstilbestrol (DES), ANGPT1 increased PCNA and decreased apoptosis while ANGPT2 reversed these effects. These results show that ANGPT1 alters steroidogenesis, reduces ovarian apoptosis, and stimulates cell proliferation in antral follicles. ANGPT1 may exert these roles by regulating ovarian vascular stability and/or by a direct effect on follicular cells, possibly involving the PI3K/AKT pathway.Fil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Irusta, Griselda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Tesone, Marta. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin