Construction of a dairy microbial genome catalog opens new perspectives for the metagenomic analysis of dairy fermented products

Microbial communities of traditional cheeses are complex and insufficiently characterized. The origin, safety and functional role in cheese making of these microbial communities are still not well understood. Metagenomic analysis of these communities by high throughput shotgun sequencing is a promising approach to characterize their genomic and functional profiles. Such analyses, however, critically depend on the availability of appropriate reference genome databases against which the sequencing reads can be aligned. We built a reference genome catalog suitable for short read metagenomic analysis using a low-cost sequencing strategy. We selected 142 bacteria isolated from dairy products belonging to 137 different species and 67 genera, and succeeded to reconstruct the draft genome of 117 of them at a standard or high quality level, including isolates from the genera Kluyvera, Luteococcus and Marinilactibacillus, still missing from public database. To demonstrate the potential of this catalog, we analysed the microbial composition of the surface of two smear cheeses and one blue-veined cheese, and showed that a significant part of the microbiota of these traditional cheeses was composed of microorganisms newly sequenced in our study. Our study provides data, which combined with publicly available genome references, represents the most expansive catalog to date of cheese-associated bacteria. Using this extended dairy catalog, we revealed the presence in traditional cheese of dominant microorganisms not deliberately inoculated, mainly Gram-negative genera such as Pseudoalteromonas haloplanktis or Psychrobacter immobilis, that may contribute to the characteristics of cheese produced through traditional methods.https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-110

Cartography of the microbial diversity from French PDO milks and cheeses and investigation of the technological drivers

International audiencePDO cheeses are generally considered as high quality, non-standardised products whose sensory richness arises from a variety of milk production and processing conditions. These practices would contribute to shaping microbial biodiversity and to the selection of ecotypes of environmental species that have adapted to the dairy environment. We seek to demonstrate this hypothesis by characterising the biotic and technological drivers of the cheese microbiota across the French PDO production areas. As a beneficiary of France Genomique major sequencing projects in 2017, MetaPDOcheese is the first large-scale study of the microbiota in all French PDO cheeses.Massive sequencing of "taxonomic marker" gene amplicons was used to describe the bacterial and fungal diversity of 1,145 cheeses and 390 milks originating from 44 PDO areas. A database consolidating all the technical information associated with the samples was also created. Up to 289 bacterial genera and 820 species, as well as 175 fungal genera and 333 species were identified from > 1 billion sequences generated from the 2,306 cheese samples (cores and rinds). Up to 549 genera and 1,230 bacterial species, as well as 671 genera and 1,367 fungal species were identified from > 180 million sequences generated from the milk samples. A core microbiome comprising several tens of bacterial and fungal taxa was identified in milk. The milk’s microbiota differed according to the dairy species. The core microbiome in cheese was limited to one fungal species (Geotrichum candidum) at 100% prevalence. A core microbiome was identified across each cheese family, mainly composed of species potentially added as starters for cheese making and ripening. The cheese microbiota differed in terms of community richness and composition between the 7 cheese families and within families, according to PDO labels. Secondary structuring factors, such as the ripening duration, were also highlighted across each cheese family

Les aliments fermentés : un nouveau regard

Dans un contexte de développement de systèmes alimentaires durables, la fermentation est un levier d’innovation pour valoriser des ressources végétales. Parmi ces ressources, les légumineuses (légumes secs, soja…) sont connues pour leurs propriétés agronomiques et nutritionnelles. Cependant, des freins à leur utilisation (préparation mal maitrisée, digestibilité difficile, …) ont entrainé une forte baisse de leur consommation en Occident depuis 50 ans, malgré leur apport en protéines de bonne qualité et peu couteuses et leurs autres atouts nutritionnels. La fermentation de ces légumineuses permettrait de les réintroduire dans la diète occidentale en les rendant plus adaptées aux attentes des consommateurs, d’augmenter leur digestibilité et de leur valeur nutritionnelle, et de diversifier les sources de protéines en remplaçant partiellement les protéines animales.Dans ce contexte, trois projets récents menés à l’INRA ont exploré la fermentation de légumineuses comme le pois, le lupin et le soja, en mélange avec du lait ou non. Le projet VEGALIM (Carnot Qualiment) visait à étudier les bénéfices sensoriels apportés par la fermentation de gels contenant 100% de protéines de pois ou un mélange de pois et de lait en mettant en place une stratégie basée sur l'assemblage raisonné de communautés microbiennes fromagères (levures et bactéries), selon leur groupe phylogénétique mais aussi sur la connaissance experte des fonctions aromatiques cibles recherchées. Dans le projet MILLup (financement INRA), des mixtes lait-farine de lupin ont été fermentés par des communautés de bactéries lactiques mésophiles. Une approche originale de criblage a associé l’exploration de génomes in silico et du phénotypage. Des communautés associant des souches métaboliquement complémentaires ont été conçues pour assurer l’hydrolyse des sucres et des protéines du lait et du lupin. Enfin, dans le projet CoLeg (financement INRA), différentes communautés microbiennes (bactéries lactiques mésophiles ou thermophiles, microorganismes de surface et associations des différents groupes) ont été utilisées pour fermenter trois légumineuses, pois jaune, soja et lupin blanc. Toutes les communautés se sont implantées, modifiant significativement la composition des milieux, différemment selon la communauté microbienne et le type de légumineuse utilisée. Des différences sensorielles marquées ont été observées, qui dépendaient principalement des communautés microbiennes. Par exemple, les milieux fermentés avec les micro-organismes de surface étaient caractérisés par des odeurs fruitées, piquantes et alcoolisées, associées à profils de composés volatils riches en esters, acides et alcools.Ces résultats montrent qu’il est possible d’implanter différentes communautés microbiennes sélectionnées sur des milieux préparés à partir de légumineuses et de générer des profils aromatiques différents, ouvrant le champ vers le développement de nouveaux aliments à partir de légumineuses fermentées

Microbial formulation of fermented foods: A new method to select microbial ecosystems efficient to generate a diversity of sensory properties

International audienceStarter addition does not always succeed in improving standardisation and quality of the complex sensory properties of traditional fermented foods. In many cases the added strains do not grow as well as the environmental strains present in the production plant. Here, a method of geometric simplification (by dichotomy) of a complex ecosystem found on a raw milk Livarot (82 strains) was tested on cheese curd. By a limited number of cultures, successively, 40 out of 82, 20 out of 40 and 10 out of 20 strains were selected on the basis of two criteria (i) respect of the taxonomic proportion, (ii) generation by the daughter ecosystems of an odour close to the one of the mother ecosystem. Finally a sub-ecosystem of 10 strains gave an odour similar to the one of the more complex mixture. The use of molecular methods (PCR-SSCP) permitted to follow the main species growing. Mother and daughter ecosystems were characterized by sensory analysis and GC–MS. Probably because of an important redundancy of the strain functions, the method was very efficient. This method may permit to improve a lot the set up of mixture of strains and species used in fermented food industry

MetaPDOcheese : Cartographie de la diversité microbienne des laits et des fromages AOP français et exploration des déterminants technologiques

National audienceLes fromages d'appellation d'origine protégée (AOP) sont généralement considérés comme des produits fermentés non standardisés de haute qualité dont la richesse sensorielle résulte de la diversité des conditions de production et de transformation du lait. Dans cette étude, l’objectif est de caractériser la diversité des communautés microbiennes des fromages et des laits associés, et d’identifier les facteurs de leur structuration en lien avec la biogéographie, la gestion des troupeaux et les pratiques de transformation fromagère. Grâce à la contribution des filières AOP, 1 145 fromages AOP (croûte et cœur) et 370 laits associés ont été échantillonnés couvrant la diversité des 44 fromages AOP affinés français. L’ampleur de l’échantillonnage des laits et des fromages et la caractérisation de leurs communautés bactériennes et fongiques par métagénétique, a permis de générer un grand jeu de données précieux car il est associé à des métadonnées sensibles fournies par les filières portant sur les pratiques de production utilisées pour chaque fromage testé. Au total, 1 230 espèces bactériennes et 1 367 espèces fongiques ont été identifiées dans les échantillons de lait, avec des variations en fonction de l'espèce laitière. Dans les fromages, 820 espèces bactériennes et 333 espèces fongiques ont été identifiées. Le core microbiome du fromage est limité à une espèce fongique (Geotrichum candidum) avec une prévalence de 100 %. Le microbiote du fromage diffère en termes de richesse et de composition entre les sept familles de fromage et au sein des familles, en fonction des labels AOP. Des facteurs structurants secondaires, tels que l'espèce laitière, la zone géographique et les pratiques d'affinage du fromage, ont également été mis en évidence entre les familles de fromages, démontrant une contribution de la biogéographie et du savoir-faire spécifique à l'AOP dans la formation du microbiote du fromage

Les aliments fermentés : un nouveau regard

Dans un contexte de développement de systèmes alimentaires durables, la fermentation est un levier d’innovation pour valoriser des ressources végétales. Parmi ces ressources, les légumineuses (légumes secs, soja…) sont connues pour leurs propriétés agronomiques et nutritionnelles. Cependant, des freins à leur utilisation (préparation mal maitrisée, digestibilité difficile, …) ont entrainé une forte baisse de leur consommation en Occident depuis 50 ans, malgré leur apport en protéines de bonne qualité et peu couteuses et leurs autres atouts nutritionnels. La fermentation de ces légumineuses permettrait de les réintroduire dans la diète occidentale en les rendant plus adaptées aux attentes des consommateurs, d’augmenter leur digestibilité et de leur valeur nutritionnelle, et de diversifier les sources de protéines en remplaçant partiellement les protéines animales.Dans ce contexte, trois projets récents menés à l’INRA ont exploré la fermentation de légumineuses comme le pois, le lupin et le soja, en mélange avec du lait ou non. Le projet VEGALIM (Carnot Qualiment) visait à étudier les bénéfices sensoriels apportés par la fermentation de gels contenant 100% de protéines de pois ou un mélange de pois et de lait en mettant en place une stratégie basée sur l'assemblage raisonné de communautés microbiennes fromagères (levures et bactéries), selon leur groupe phylogénétique mais aussi sur la connaissance experte des fonctions aromatiques cibles recherchées. Dans le projet MILLup (financement INRA), des mixtes lait-farine de lupin ont été fermentés par des communautés de bactéries lactiques mésophiles. Une approche originale de criblage a associé l’exploration de génomes in silico et du phénotypage. Des communautés associant des souches métaboliquement complémentaires ont été conçues pour assurer l’hydrolyse des sucres et des protéines du lait et du lupin. Enfin, dans le projet CoLeg (financement INRA), différentes communautés microbiennes (bactéries lactiques mésophiles ou thermophiles, microorganismes de surface et associations des différents groupes) ont été utilisées pour fermenter trois légumineuses, pois jaune, soja et lupin blanc. Toutes les communautés se sont implantées, modifiant significativement la composition des milieux, différemment selon la communauté microbienne et le type de légumineuse utilisée. Des différences sensorielles marquées ont été observées, qui dépendaient principalement des communautés microbiennes. Par exemple, les milieux fermentés avec les micro-organismes de surface étaient caractérisés par des odeurs fruitées, piquantes et alcoolisées, associées à profils de composés volatils riches en esters, acides et alcools.Ces résultats montrent qu’il est possible d’implanter différentes communautés microbiennes sélectionnées sur des milieux préparés à partir de légumineuses et de générer des profils aromatiques différents, ouvrant le champ vers le développement de nouveaux aliments à partir de légumineuses fermentées

Assembly of communities for the fermentation of cereals and protein crops

Assembly of communities for the fermentation of cereals and protein crops. 2017 Scientific MEM days: Journées scientifiques MEM (Métaomiques et écosystèmes microbiens

Assembly of communities for the fermentation of cereals and protein crops

Assembly of communities for the fermentation of cereals and protein crops. 2017 Scientific MEM days: Journées scientifiques MEM (Métaomiques et écosystèmes microbiens

Novel extraction strategy of ribosomal RNA and genomic DNA from cheese for PCR-based investigations

International audienceCheese microorganisms, such as bacteria and fungi, constitute a complex ecosystem that plays a central role in cheeses ripening. The molecular study of cheese microbial diversity and activity is essential but the extraction of high quality nucleic acid may be problematic: the cheese samples are characterised by a strong buffering capacity which negatively influenced the yield of the extracted rRNA. The objective of this study is to develop an effective method for the direct and simultaneous isolation of yeast and bacterial ribosomal RNA and genomic DNA from the same cheese samples. DNA isolation was based on a protocol used for nucleic acids isolation from anaerobic digestor, without preliminary washing step with the combined use of the action of chaotropic agent (acid guanidinium thiocyanate), detergents (SDS, N-lauroylsarcosine), chelating agent (EDTA) and a mechanical method (bead beating system). The DNA purification was carried out by two washing steps of phenol–chloroform. RNA was isolated successfully after the second acid extraction step by recovering it from the phenolic phase of the first acid extraction. The novel method yielded pure preparation of undegraded RNA accessible for reverse transcription–PCR. The extraction protocol of genomic DNA and rRNA was applicable to complex ecosystem of different cheese matrices

An iterative sensory procedure to select odor-active associations in complex consortia of microorganisms: Application to the construction of a cheese model

International audienceThe aim of this study was to develop and validate an iterative procedure based on odor assessment to select odor-active associations of microorganisms from a starting association of 82 strains (G1), which were chosen to be representative of Livarot cheese biodiversity. A 3-step dichotomous procedure was applied to reduce the starting association G1. At each step, 3 methods were used to evaluate the odor proximity between mother (n strains) and daughter (n/2 strains) associations: a direct assessment of odor dissimilarity using an original bidimensional scale system and 2 indirect methods based on comparisons of odor profile or hedonic scores. Odor dissimilarity ratings and odor profile gave reliable and sometimes complementary criteria to select G3 and G4 at the first iteration, G31 and G42 at the second iteration, and G312 and G421 at the final iteration. Principal component analysis of odor profile data permitted the interpretation at least in part, of the 2D multidimensional scaling representation of the similarity data. The second part of the study was dedicated to 1) validating the choice of the dichotomous procedure made at each iteration, and 2) evaluating together the magnitude of odor differences that may exist between G1 and its subsequent simplified associations. The strategy consisted of assessing odor similarity between the 13 cheese models by comparing the contents of their odor-active compounds. By using a purge-and-trap gas chromatography-olfactory/mass spectrometry device, 50 potent odorants were identified in models G312, G421, and in a typical Protected Denomination of Origin Livarot cheese. Their contributions to the odor profile of both selected model cheeses are discussed. These compounds were quantified by purge and trap-gas chromatography-mass spectrometry in the 13 products and the normalized data matrix was transformed to a between-product distance matrix. This instrumental assessment of odor similarities allowed validation of the choice of G312 as the best 10-strain ecosystem