<<Ανθρώπινες μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα- Βιολογική ενδοκυττάρια δράση>>

Τα φυσικά αντισώματα (NAbs), ανευρίσκονται στον ορό υγιών ατόμων χωρίς προηγούμενη εξωγενή αντιγονική διέγερση. Το κύριο χαρακτηριστικό των NAbs είναι η πολυδραστικότητα, δηλαδή η ικανότητα να αναγνωρίζουν ένα ευρύ φάσμα δομικά διαφορετικών αντιγόνων του ‘εαυτού’ και του ‘ξένου’. Η ιδιότητα της πολυδραστικότητας προσδίδει στα NAbs έναν πολυδιάστατο βιολογικό ρόλο με κύριες λειτουργίες την ανοσορύθμιση και την διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. Ένας διακριτός υποπληθυσμός των NAbs, τα φυσικά κυτταροδιεισδυτικά αντισώματα (CPAbs), κατέχει την ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα και ενδοκυττάριου εντοπισμού στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα. Η ιδιότητα αυτή φαίνεται να συνδεεται αμεσα με την πολυδραστικότητα που φέρουν τα CPAbs ως μέρος του συνόλου των φυσικών αντισωμάτων. Ο χαρακτηρισμός και ο προσδιορισμός του βιολογικού ρόλου μονοκλωνικών φυσικών CPAbs αποτελεί ένα ενδιαφέρον πεδίο για καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις με κύριο πλεονέκτημα την έλλειψη τοξικότητας. Η μελέτη των NAbs, θα μπορούσε να παρέχει καινοτόμες εφαρμογές στην θεραπεία του καρκίνου ενώ παράλληλα μελέτες υποδεικνύουν έναν διακριτό και ύψιστης σημασίας ρόλο στην ανοσολογική επιτήρηση του οργανισμού ως μία από τις βασικότερες βιολογικές τους λειτουργίες. Η εξειδικευμένη ικανότητα αναγνώρισης, ογκο- ειδικών αντιγονικών στόχων (TACAs) στα εξαλλαγμένα κύτταρα από τα NAbs, φαίνεται πως είναι απόρροια της πολυδραστικής τους φύσης, αναγνωρίζοντας συντηρημένα αντιγονικά μοτίβα τα οποία εμφανίζονται κατά τις διεργασίες της εξαλλαγής των κυττάρων στην επιφάνειά τους. Το εργαστήριο Ανοσολογίας του Ινστιτούτου Παστέρ ασχολείται τα τελευταία χρόνια με την μελέτη των NAbs. Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν μονοκλωνικά CPAbs προερχόμενα από υγιή BALBc ποντίκια καθώς και για πρώτη φορά, πολυκλωνικά IgG- CPAbs ανθρώπινης προέλευσης που ανευρίσκονται στο σκεύασμα της ενδοφλέβιας ανοσοσφαιρίνης (IVIG). Στις τελευταίες μελέτες του εργαστηρίου, συμπεριλαμβανομένης και της παρούσας εργασίας, έγιναν προσπάθειες χαρακτηρισμού μονοκλωνικών CPAbs ανθρώπινης προελεύσεως. Σε συνδυασμό με τις παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου και των βιβλιογραφικών δεδομένων, έχει φανεί πως σε ορούς ασθενών με πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες (PCDs) ανευρίσκονται με υψηλή συχνότητα μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες που φέρουν χαρακτηριστικά όμοια με αυτά των NAbs. Πληθώρα μελετών υποδεικνύει, πως σε πολλές περιπτώσεις οι παραγόμενες μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες είναι πλήρως λειτουργικά μόρια, ενώ έχουν υπάρξει πολυάριθμες αναφορές πως αυτά συχνά στοχεύουν εαυτά και ξένα αντιγόνα εμφανίζοντας παράλληλα τον πολυδραστικό χαρακτήρα των NAbs. Υπαρχουν επομενως, ισχυρες ενδειξεις ότι κάποιοι από τους Β κλώνους που προσβάλλονται και πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, αποτελούν B κλώνους που παράγουν NAbs. Με βάση αυτό το δεδομένο, το εργαστήριο στράφηκε στην απομόνωση ανθρώπινων μονοκλωνικών φυσικών αντισωμάτων από ορούς ασθενών με PCDs με σκοπό τον χαρακτηρισμό τους και της μελέτης της βιολογικής τους δράσης. Στην παρούσα εργασία, απομονώθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα τάξης IgG από έξι (6) ορούς ασθενών με Πολλαπλούν Μυέλωμα και έξι (6) αντισώματα τάξης IgM από ορούς ασθενών με μακροσφαιριναιμία Waldenström. Με την χρήση της τεχνικής ELISA προσδιορίστηκε η πολυδραστικότητά τους, ενώ παράλληλα, μελετήθηκε η ικανότητα αυτών να διεισδύουν σε ζώντα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης προελεύσεως [MDA-MB-231 (FcRγ+), HeLa (FcRγ-)]. Τέλος μελετήθηκε η επίδραση της βιολογικής τους δρασης έναντι των παραπάνω καρκινικών σειρών, ως προς την ικανότητά τους να επάγουν απόπτωση ή/και κυτταροτοξικότητα. Τα συμπεράσματα της μελέτης συννενούν στο γεγονός πως τα απομονωθέντα αντισώματα φέρουν χαρακτηριστικά όμοια με αυτά των NAbs, ενώ παράλληλα κάποια από αυτά φάνηκε πως ανήκουν στον υποπληθυσμό των CPAbs εμφανίζοντας ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα μέσω είτε ενεργο- εξαρτώμενων είτε ενεργο- ανεξάρτητων μηχανισμών. Στη μελέτη μας, φάνηκε πως μετά από επώαση των κυτταρικών σειρών με τα mIgGs, αυτά είχαν την ικανότητα να επάγουν τους αποπτωτικούς μηχανισμούς στα καρκινικά κύτταρα, ενώ παράλληλα τα mIgMs οδήγησαν σε αυξημένα ποσοστά κυτταροτοξικότητας. Συμπερασματικά, φάνηκε πως οι οροί ασθενών με PCDs, αποτελούν μια αξιοποιήσιμη πηγή φυσικών μονοκλωνικών αντισωμάτων, παρέχοντας την δυνατότητα τής περαιτέρω μελέτης των χαρακτηριστικών και των βιολογικών ιδιοτήτων των αντισωμάτων αυτών. Τα NAbs, λόγω των ξεχωριστών ιδιοτήτων τους, αποτελούν ένα δελεαστικό πεδίο μελέτης σε επίπεδο βασικής έρευνας, ενώ στο πεδίο της εφαρμοσμένης έρευνας μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αυτούσια θεραπευτικά μόρια ή ως φορείς βιοδραστικών ουσιών. Τέλος, μία πρωτοποριακή ιδέα, είναι και η συνδυαστική χρήση τους ως μεταφορείς ουσιών οι οποίοι παράληλλα φέρουν και ενδογενή δραστικότητα. Η ικανότητα της εξειδικευμένης, πολλαπλής στόχευσης με τη χρήση των φυσικών CPAbs αποτελεί λοιπόν, ένα από τα μεγαλύτερα πλεονεκτήματα της μελέτης και της εφαρμογής τους στη θεραπεία.Natural antibodies (Naturally occurring Antibodies- NAbs) are antibodies present in the serum of healthy subjects without previous antigenic stimulation. NAbs have the ability to recognize self-and no self- antigens providing a surveillance system of the organism’s molecular state and confers to homeostasis, acting as a humoral element of innate immunity. Cell penetrating antibodies- CPAbs, a distinct subpopulation of NAbs, have the ability to penetrate living cells and accumulating in the cytoplasm or the nucleus. Polyreactivity seems to be directly related to the penetration ability of CPAbs and therefore they represent a potential pharmaceutical weapon against various diseases. More specifically the use of NAbs in cancer therapy has gained a lot of interest. Particularly, IgM- NAbs recognize specifically antigens on the surface of tumor cells called tumor-associated-carbohydrate-antigens (TACAs) and the polyreactive nature of these NAbs seems to play a major role in this recognition. The Immunology Laboratory of the Hellenic Pasteur Institute has been working on the characterization of natural antibodies, mostly on CPAbs subpopulation. In more detail, monoclonal natural CPAbs from BALB/c mice were isolated and the sub group of IgG- CPAbs was detected in the commercial preparation of intravenous immunoglobulin (IVIG). Latest studies, including the present one, were focused on the isolation of human monoclonal CPAbs from the sera of patients with plasma cell dyscarias (PCDs). In PCDs pathogenesis, a B cell clone starts randomly to over multiple itself, suppressing the others and resulting in the production of high levels of monoclonal Igs in the serum. In most cases, these mIgs are functional. Literature provides evidence that mIgs producing B-cell clones that have undergone malignancy may under physiological conditions produce NAbs. With this in mind, our labatory focused in the research of human monoclonal “natural” CPAbs derived from the sera of patients with PCDS. In this study, six (6) mIgGs from sera of patients with Multiple Myeloma and six (6) mIgMs from sera of patients with Waldenström’s macroglobulinemia were selected and isolated based on their ability to act as polyreactive antibodies. With the use of ELISA we identified their polyreactivity and examined their ability to penetrate into cancer cells (HeLa and MDA-MB-231) in vitro. Subsequently, we examined their biological function on the above human cancer cells, their ability to induce apoptosis and/ or cytotoxicity, and lastly their possible catalytic activities, by hydrolyzing nucleic acids. Our results validate that the isolated mIgs share common features with NAbs and indicate that some of them have the ability to penetrate living cells through energy- depended and/ or energy- independed manner. Our study on the biological effect of our isolated mAbs indicates that mIgGs induce mainly apoptosis on the cancer cells studied, whereas mIgMs showed a distinct cytotoxic effect. In conclusion, we demonstrate that sera of patients with PCDs represent an excellent source of natural antibodies, which can be exploited in a wide range of applications. Indeed, the multiple biological functions of NAbs make them a potential therapeutic tool in therapy and diagnosis of many disorders such as cancer. Natural CPAbs can be used for drug delivery, to deliver intracellular compounds with the desired biological activity, or they can be used in therapy per se as they express their own biological activities. Finally an innovative use of natural CPAbs could be their combinational use as carriers of biologically effective drugs, having together a desirable endogenous biological activity

Natural autoimmunity in oligoarticular juvenile idiopathic arthritis

Abstract Background Oligoarticular juvenile idiopathic arthritis (oligo-JIA) is considered as an antigen-driven lymphocyte-mediated autoimmune disease. Natural antibodies (NAbs) are pre-immune antibodies produced in the absence of exogenous antigen stimulation, participating in both, innate and adaptive immunity. Considering their major immunoregulatory role in homeostasis and autoimmune pathogenesis, we designed this study to further elucidate their role in oligo-JIA pathogenesis. Methods Seventy children with persistent oligo-JIA and 20 healthy matched controls were enrolled in the study. Serum IgM and IgA antibodies against human G-actin, human IgG F(ab΄)2 fragments and the hapten TriNitroPhenol (TNP) as well as the total concentration of serum IgM and IgA were measured by in-house enzyme-immunoassays. Kolmogorov–Smirnov normality test, Kruskal–Wallis H and Mann–Whitney tests were used to assess data distribution, and significant differences of non-parametric data between groups of the study. Backward regression analysis was used to analyze the effect of multiple factors (age, gender, disease activity, anti-nuclear antibody positivity, presence of uveitis) on continuous dependent variables (activities and activity/ concentration ratios of IgM and IgA NAbs). Results The ratios of IgA anti-TNP, anti-actin and anti-F(ab΄)2 levels to total serum IgA concentration were found to be significantly increased in patients with oligo-JIA compared to healthy subjects. Significantly elevated levels of IgM anti-TNP antibodies were also found in children with inactive oligo-JIA compared to those of children with active disease and of healthy controls. In the presence of anterior uveitis, IgM anti-TNP levels were significantly higher than in patients without uveitis or in healthy controls. Backward regression analysis revealed that the disease activity and the presence of anterior uveitis independently affect IgM anti-TNP levels. Conclusuions Our findings are in accordance with the hypothesis that NAbs contribute to the pathogenesis of autoimmune diseases and provide additional evidence that disturbances in natural autoimmunity may contribute to the as yet unclarified pathogenesis of oligo-JIA

Table S1

Natural antibodies targeting LPS in pleural effusions of various etiologies.</p

Table S2

Natural antibodies targeting LPS in pleural effusions of various etiologies</p

Figure S1.jpg

Natural antibodies targeting LPS in pleural effusions of various etiologies.</p

Table S3

Natural antibodies targeting LPS in pleural effusions of various etiologies</p

Table S4

Natural antibodies targeting LPS in pleural effusions of various etiologies</p

Levels of Circulating IgM and IgY Natural Antibodies in Broiler Chicks: Association with Genotype and Farming Systems

Naturally occurring antibodies (NAbs), which are major components of innate immunity, exist in circulation under healthy conditions without prior antigenic stimulation and are able to recognize both self- and non-self-constituents. The present study aimed at identifying potential immunological differences between commercial fast- and slow-growth broilers (n = 555) raised in conventional and free-range systems, respectively, through the use of the specificity, isotypes and levels of circulating NAbs. The possible beneficial effect of oregano-based dietary supplementation was also evaluated. To this end, serum IgM and IgY NAbs against self- (actin and DNA) and non-self- antigens (trinitrophenol and lipopolysaccharide) were measured by ELISA and further correlated with genotype, season and performance. Significantly higher levels of IgM NAbs against all antigens were found in slow-growth compared to fast-growth broilers. IgM NAb levels were also significantly increased in dietarily supplemented slow-growth broilers versus those consuming standard feed. Moreover, significantly elevated levels of anti-DNA IgY NAbs were found in fast-growth compared to slow-growth broilers, whereas the opposite was observed for anti-LPS IgY NAbs. Multivariate linear regression analysis confirmed multiple interactions between NAb levels, genotype, season and performance. Overall, serum NAbs have proven to be valuable innovative immunotools in the poultry industry, efficiently differentiating fast-growing versus slow-growing broilers, and dietary supplementation of plant extracts can enhance natural immunity

Combined monitoring of IgG and IgA anti-Spike and anti-Receptor binding domain long term responses following BNT162b2 mRNA vaccination in Greek healthcare workers

International audienceStudies on the humoral response to homologous BNT162b2 mRNA-vaccination focus mainly on IgG antibody dynamics, while long-term IgA kinetics are understudied. Herein, kinetics of IgG and IgA levels against trimeric-Spike (S) and Receptor-Binding-Domain (RBD) were evaluated by in-house ELISAs in 146 two-dose vaccinated Greek healthcare workers (HCWs) in a 9-month period at six time points (up to 270 days after the first dose). The effect of a homologous booster third dose was also studied and evaluated. The peak of immune response was observed 21 days after the second dose; 100% seroconversion rate for anti-S and anti-RBD IgG, and 99.7% and 96.3% respectively for IgA. IgG antibody levels displayed higher increase compared to IgA. Declining but persistent anti-SARS-CoV-2 antibody levels were detected 9 months after vaccination; IgG and IgA anti-S levels approached those after the first dose, while a more rapid reduction rate for anti-RBD antibodies led to significantly lower levels for both classes, supporting the need for a booster dose. Indeed, a homologous booster third dose resulted in enhanced levels of anti-S of both classes, whereas anti-RBD didn’t exceed the peak levels after the second dose. Previous SARS-CoV-2 infection, flu vaccination, BMI<35 and the occurrence of an adverse event upon vaccination, were associated with higher IgG antibody levels over time, which however were negatively affected by age increase and the presence of chronic diseases. Overall, after concurrently using the S and RBD target-antigens in in-house ELISAs, we report in addition to IgG, long-term persistence of IgA antibodies. Regarding antibody levels, homologous mRNA vaccination gives rise to an effective anti-viral protection up to 9 months negatively correlated to age. Considering that COVID-19 is still a matter of public concern, booster vaccine doses remain critical to vulnerable individuals