Design of an integrated process for bioethanol production from lignocellulosic materials

The aim of the present thesis was the design of an integrated process of bioethanol production from lignocellulosic materials. Sweet sorghum (SS) is considered an important raw material for bioethanol production, due to its high biomass yields and sugar content. Sorghum bagasse (SB), the solid residue after extraction of sugars, is rich in cellulose and hemicellulose. For the bioconversion of SS and SB to ethanol the fungi Fusarium oxysporum F3 and Neurospora crassa DSM 1129 were used, because they possess the abilities to produce the required cellulolytic enzymes and also ferment their hydrolysis products (sugars) to ethanol. Both fungi were able to secrete adequate activities of cellulases and hemicellulases when grown on agricultural residues combined with inorganic nitrogen sources. The above fungi were able to ferment the whole spectrum of sugars and polysaccharides that are present in SS into ethanol, with good yields. On the other hand, ethanol production from raw SB was low. Thus, the hydrothermal pretreatment of SB was studied, at various temperatures (160ο-210οC) and treatment times (3-30 min), with the addition of dilute sulfuric acid (0-4g/100g SB), resulting in high hemicellulose degradation. The concentrations of the inhibitors (furfural, 5-hydroxymethyl furfural and formic acid) produced during pretreatment were kept at low levels. Combing the hydrothermal pretreatment of SB (210οC, 10 min, 2g sulfuric acid/100g SB) and the addition of commercial cellulases (6 FPU/g SB) at the fermentation step resulted in substantial increase in ethanol yield. The maximum ethanol production by N. crassa was 27.6 g/L (31.5 g/100g total solids), or 82.3% of maximum theoretical yield, while the production by mixed cultures of F. oxysporum F3 and the yeast Saccharomyces cerevisiae 2541 was lower, 13.6 g/L (16 g/100g total solids) or 40.5% of theoretical yield. The genetic engineering of the wild type strain F3 resulted in improved ethanol production. The engineered strain FF11 (constituent expression of hexoses and pentoses metabolism enzymes, phosphoglucomutase and transaldolase, respectively) showed increased bioconversion yields of SS and SB, compared to the wild type strain F3Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός ολοκληρωμένης διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά. Το γλυκό σόργο (ΓΣ) θεωρείται εξαιρετική πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης, λόγω των υψηλών αποδόσεών του σε βιομάζα και του υψηλού ποσοστού άμεσα ζυμώσιμων σακχάρων του χυμού του. Το στερεό υπόλειμμα της εκχύλισης των σακχάρων του, η βαγάσση σόργου (ΒΣ), είναι πλούσιο σε κυτταρίνη και ημικυτταρίνη. Για την βιομετατροπή του ΓΣ και της ΒΣ σε αιθανόλη χρησιμοποιήθηκαν οι μύκητες Fusarium oxysporum F3 και Neurospora crassa DSM 1129, οι οποίοι διαθέτουν την ικανότητα παραγωγής των απαραίτητων υδρολυτικών ενζύμων και της βιομετατροπής των προϊόντων της υδρόλυσης (σάκχαρα) σε αιθανόλη. Οι δύο μύκητες παρήγαγαν ικανοποιητικές ενεργότητες κυτταρινασών και ημικυτταρινασών όταν αναπτύχθηκαν σε πηγές άνθρακα αγροτικών υπολειμμάτων σε συνδυασμό με ανόργανες πηγές αζώτου. Οι παραπάνω μύκητες μπορούν να μεταβολίσουν σε αιθανόλη όλο το φάσμα των σακχάρων και πολυσακχαριτών που περιέχονται στο ΓΣ, με ικανοποιητικές αποδόσεις. Όμως η παραγωγή αιθανόλης από ακατέργαστη ΒΣ διατηρήθηκε σε χαμηλά επίπεδα. Έτσι, μελετήθηκε η υδροθερμική προκατεργασία της ΒΣ, σε διάφορες θερμοκρασίες (160ο-210οC) και χρόνους κατεργασίας (3-30 min), με προσθήκη αραιού θειικού οξέος (0-4g/100g SB), η οποία οδήγησε σε υψηλά ποσοστά αποικοδόμησης της ημικυτταρίνης. Οι συγκεντρώσεις των παρεμποδιστών (φουρφουράλη, 5-υδροξυμεθυλ-φουρφουράλη και μυρμηγκικό οξύ) που σχηματίστηκαν κατά την υδροθερμική προκατεργασία ήταν χαμηλές. Ο συνδυασμός της υδροθερμικής προκατεργασίας της ΒΣ (210οC, 10 min, 2g θειικού οξέος/100g ΒΣ) με την προσθήκη εμπορικών κυτταρινασών (6 FPU/g υλικού) οδήγησε σε σημαντική αύξηση της απόδοσης αιθανόλης. Η μέγιστη παραγωγή αιθανόλης από τον N. crassa ήταν τα 27.6 g/L (31.5 g/100g συνολικών στερεών), ή 82.3% της θεωρητικής. Αντίστοιχα, η παραγωγή αιθανόλης από τον μύκητα F. oxysporum F3 σε μικτές καλλιέργειες με τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae 2541 ανήλθε στα 13.6 g/L (16 g/100g συνολικών στερεών) ή 40.5% της θεωρητικής. Η γενετική τροποποίηση του φυσικού στελέχους F3 οδήγησε σε βελτίωση της παραγωγής αιθανόλης. Το τροποποιημένο στέλεχος FF11 (συνεχής έκφραση των ενζύμων φωσφογλυκομουτάσης του μεταβολισμού των εξοζών και τρανσαλδολάσης του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών) παρουσίασε αυξημένες αποδόσεις βιομετατροπής σε αιθανόλη του ΓΣ και της ΒΣ σε σχέση με το φυσικό στέλεχος F