Αυτοφαγία στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα: ο ρόλος του HIF-1α/REDD1 μοριακού μονοπατιού

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα κλωνικών διαταραχών των αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων (Hematopoietic Stem Cells – HSCs) ή προγονικών κυττάρων (Hematopoietic Progenitor Cells – HPCs). Η τεκμηριωμένη εξάρτηση των προγονικών κυττάρων των ΜΔΣ από το υποξικό περιβάλλον του μυελού των οστών (ΜΟ) έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στον επαγόμενο από την υποξία μεταγραφικό παράγοντα 1 (Hypoxia Inducible Factor 1 – HIF-1). Ο HIF-1 διαμεσολαβεί τη διατήρηση της ηρεμίας και ρυθμίζει τη διαφοροποίηση τροποποιώντας το μεταβολισμό των HSCs, αποτελώντας έτσι έναν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο. Στο πρώτο τμήμα της παρούσας μελέτης, διερευνήθηκε η παθολογική σταθεροποίηση του HIF-1 στο ΜΟ ασθενών με ΜΔΣ. Μέθοδοι: Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ και οστεομυελικές βιοψίες συλλέχθηκαν από 16 ασθενείς με πρωτοδιάγνωση ΜΔΣ και από 7 μάρτυρες χωρίς κακοήθη αιματολογική διαταραχή. Μελέτη με qRT-PCR και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε αντίστοιχα για την εκτίμηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του HIF-1α και του άμεσου μεταγραφικού στόχου του HIF-1, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) σε δείγματα αναρρόφησης ΜΟ. Η αυτοφαγία και η μιτοφαγία μελετήθηκαν με ανοσοφθορισμό και παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs ΜΟ με κατεύθυνση διαφοροποίησης προς μυελική σειρά με τη χρήση ενός λειτουργικού αναστολέα του HIF-1α. Αποτελέσματα: Δείξαμε ότι η παθολογική έκφραση και μεταγραφική δραστηριότητα του HIF-1α είναι ανεξάρτητη από το οξυγόνο τεκμηριώνοντας το φαινόμενο της ψευδοϋποξίας στο ΜΟ των ΜΔΣ. Ακολούθως, μελετήσαμε την ποιότητα και την ποσότητα των μιτοχονδρίων παράλληλα με τα επίπεδα αυτοφαγίας στα διαφοροποιούμενα κύτταρα της μυελικής σειράς μετά την απομόνωση από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ, δεδομένου ότι και τα δύο φαινόμενα είναι εξαρτώμενα από τον HIF-1. Δείξαμε ότι η μιτοφαγία των παθολογικών μιτοχονδρίων και ο αυτοφαγικός θάνατος αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της μυελικής σειράς των ΜΔΣ, με τη βαρύτητά τους να αυξάνεται με το ποσοστό των βλαστών του ΜΟ. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs απομονωμένων από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ προκειμένου να επηρεάσομε την έκφραση του HIF-1 και να μελετήσουμε το δυναμικό του ως θεραπευτικού στόχου. Διαπιστώσαμε ότι παρότι οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε παροχή οξυγόνου 21%, ο HIF-1 παρέμενε παθολογικά σταθερός σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ. Η αναστολή του HIF-1α είχε διαφορετικού βαθμού θετική επίδραση σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ με < 5% βλάστες, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στις καλλιέργειες των ΜΔΣ με ≥5% βλάστες, οι οποίες δεν επιβίωναν μετά την τρίτη μέρα της καλλιέργειας. Συμπεράσματα: Συμπεραίνουμε ότι ο HIF-1 και η ψευδοϋποξία αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της παθοφυσιολογίας των ΜΔΣ και η επίδραση επί αυτών μπορεί να έχει κάποιο δυναμικό στη θεραπευτική των ήπιων ΜΔΣ. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, διερευνήσαμε τα διαφορετικά μεταβολικά προφίλ της μυελικής σειράς ΜΔΣ με χαμηλά και υψηλά ποσοστά βλαστών. Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση των διαφοροποιούμενων κυττάρων της μυελικής σειράς από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ 23 ασθενών με ΜΔΣ με <5% (G1) ή ≥5% (G2) βλάστες, με στόχο να διερευνήσουμε το ρόλο του μεταβολισμού στη βαρύτητα και το κακόηθες δυναμικό των ΜΔΣ. Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ συλλέχθηκαν από 14 ασθενείς με ΜΔΣ, οι οποίοι δεν είχαν λάβει θεραπεία (G1, n=10 και G2, n=4) και από αντίστοιχης ηλικίας μάρτυρες (n=5). Μετά από απομόνωση των κυττάρων της μυελικής σειράς, πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση. Η επεξεργασία και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το Metabokit. Η ανάλυση εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Metaboanalyst v4 με εφαρμογή σχετιζόμενων με μονοπάτια ομάδων μεταβολιτών. Αποτελέσματα: Τεκμηριώσαμε ένα βιοενεργητικό προφίλ που συντονίζεται από το φαινόμενο Warburg και στις δύο ομάδες, με σημαντικά διαφορετικό αποτέλεσμα που εξαρτάται από τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και την οξειδοαναγωγική κατάσταση κάθε ομάδας. Τα κύτταρα της ομάδας G1 παρουσιάζουν συσσώρευση ενδιάμεσων μεταβολιτών της γλυκόλυσης λόγω δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων, ενώ η λειτουργική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και η βελτιωμένη οξειδοαναγωγή της ομάδας G2 εξισορροπεί τη διαταραχή Warburg. Το μεταβόλομα και των δύο ομάδων παρουσιάζει αφθονία επιγενετικών τροποποιητών. Το μεταβόλομα της ομάδας G1 και G2 διαφέρει και τελικά καθορίζει τον κλινικό φαινότυπο του ΜΔΣ, καθώς και το δυναμικό για κακοήθη μετατροπή. Συμπέρασμα: Τα ευρήματά μας προτείνουν ότι ο διαταραγμένος μεταβολισμός συμμετέχει στην παθογένεση του συνδρόμου και καθορίζει επίσης τη βαρύτητα της νόσου. Προτείνουμε επίσης ότι αυτές οι βιοενεργητικές μεταβολές χαρακτηρίζουν και οδηγούν τη λευχαιμική μετατροπή. Τα δεδομένα μας δεν παρέχουν απλά μια νέα θεώρηση στην παθοφυσιολογία των ΜΔΣ, αλλά τροποποιούν και την επικρατούσα άποψη για τη βιολογία της σχετιζόμενης με ΜΔΣ ΟΜΛ.Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of clonal hematopoietic stem (HSCs) and/or progenitor cells (HPCs) disorders. The established dependence of MDS progenitors on the hypoxic bone marrow (BM) microenvironment turned scientific interests to the transcription factor Hypoxia-Inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 facilitates quiescence maintenance and regulates differentiation by manipulating HSCs metabolism, being thus an appealing research target. In the first section of the study, we examine the aberrant HIF-1 stabilization in BMs from MDS patients. Methods: BΜ aspiration samples, as well as BM biopsies, were collected from 16 newly diagnosed previously untreated MDS patients and 7 controls with non-malignant hematologic disorder. qRT-PCR and flow cytometry analysis were respectively used for the assessment of mRNA and protein levels of HIF-1α and HIF-1 direct transcriptional target, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1), in BM aspiration samples A nitroimidazole-indocyanine conjugate was used for the study of the hypoxic phenotype in BM biopsies, as well as in cultured CD34+ BM cells. Autophagy and mitophagy were examined by means of immunofluorescence and electron microscopy. We finally performed in vitro cultures of human BM derived CD34+ HSCs under myeloid priming using a functional HIF-1α inhibitor. Results: We show that HIF-1 aberrant expression and transcription activity is oxygen independent establishing the phenomenon of pseudohypoxia in MDS BM. Next, we examine mitochondrial quality and quantity along with levels of autophagy in the differentiating myeloid lineage isolated from fresh BM MDS and control aspirates given that both phenomena are HIF-1 dependent. We show that mitophagy of abnormal mitochondria and autophagic death are prominently featured in the MDS myeloid lineage, their severity increasing with intra-BM blast counts. Finally, we use in vitro cultured CD34+ HSCs isolated from fresh human BM aspirates to manipulate HIF-1 expression and examine its potential as a therapeutic target. We find that despite cultured under 21% O2, HIF-1 remained aberrantly stable in all MDS cultures. Inhibition of HIF-1α subunit had a variable beneficial effect in all <5%-intra-BM blasts-MDS, while it had no effect in controls or in >5%-intra-BM blasts-MDS that uniformly died within 3 days of culture. Conclusions: We conclude that HIF-1 and pseudohypoxia are prominently featured in MDS pathobiology and their manipulation has some potential in the therapeutics of benign MDS. In the second section of the study, we examine the different metabolic profile of MDS myeloid lineage with low and high BM blast percentage. Methods: We performed an untargeted metabolomic analysis of differentiating myeloid lineage cells from MDS BM aspirates that exhibited <5% (G1) or ≥5% (G2) blasts, in order to delineate its role in MDS severity and malignant potential. BM aspirates were collected from 14 previously untreated MDS patients (G1, n = 10 and G2, n = 4) and age matched controls (n = 5). Following myeloid lineage cell isolation, untargeted mass spectrometry-based metabolomics analysis was performed. Data were processed and analyzed using Metabokit. Enrichment analysis was performed using Metaboanalyst v4 employing pathway-associated metabolite sets. 25 Results: We established a bioenergetic profile coordinated by the Warburg phenomenon in both groups, but with a massively different outcome that mainly depended upon each group mitochondrial function and redox state. G1 cells are overwhelmed by glycolytic intermediate accumulation due to failing mitochondria, while the functional electron transport chain and improved redox in G2 compensate for Warburg disruption. Both metabolomes reveal the production and abundance of epigenetic modifiers. G1 and G2 metabolomes differ and eventually determine the MDS clinical phenotype, as well as the potential for malignant transformation. Conclusion: Our findings suggest that a perturbed metabolism underlies the syndrome’s pathogenesis and also determines the disease severity. We also propose that these bioenergetic alterations are essentially featured in and indeed drive the process of leukemic transformation. Our data not only offer novel insight into the elusive MDS pathophysiology, but also change our viewpoint on MDS-related acute myeloid leukemia biology

Simultaneous occurrence of cerebellar medulloblastoma and pituitary adenoma: A case report

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Licens

Genomic investigations of unexplained acute hepatitis in children

Since its first identification in Scotland, over 1,000 cases of unexplained paediatric hepatitis in children have been reported worldwide, including 278 cases in the UK1. Here we report an investigation of 38 cases, 66 age-matched immunocompetent controls and 21 immunocompromised comparator participants, using a combination of genomic, transcriptomic, proteomic and immunohistochemical methods. We detected high levels of adeno-associated virus 2 (AAV2) DNA in the liver, blood, plasma or stool from 27 of 28 cases. We found low levels of adenovirus (HAdV) and human herpesvirus 6B (HHV-6B) in 23 of 31 and 16 of 23, respectively, of the cases tested. By contrast, AAV2 was infrequently detected and at low titre in the blood or the liver from control children with HAdV, even when profoundly immunosuppressed. AAV2, HAdV and HHV-6 phylogeny excluded the emergence of novel strains in cases. Histological analyses of explanted livers showed enrichment for T cells and B lineage cells. Proteomic comparison of liver tissue from cases and healthy controls identified increased expression of HLA class 2, immunoglobulin variable regions and complement proteins. HAdV and AAV2 proteins were not detected in the livers. Instead, we identified AAV2 DNA complexes reflecting both HAdV-mediated and HHV-6B-mediated replication. We hypothesize that high levels of abnormal AAV2 replication products aided by HAdV and, in severe cases, HHV-6B may have triggered immune-mediated hepatic disease in genetically and immunologically predisposed children

Μελέτη των πολυμορφισμών του Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) στις θρομβώσεις των οφθαλμικών αγγείων

O ενεργοποιούμενος από τη θρομβίνη αναστολέας της ινωδόλυσης (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor – TAFI), ένα ένζυμο με δράση καρβοξυπεπτιδάσης, αποτελεί ένα από τα σημεία σύνδεσης και αλληλεπίδρασης του μονοπατιού της πήξης με εκείνο της ινωδόλυσης. Δρα διασπώντας τα καρβοξυτελικά κατάλοιπα λυσίνης από την επιφάνεια της ινικής, στερώντας με αυτόν τον τρόπο τις θέσεις δέσμευσης του πλασμινογόνου και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου στην ινική, με αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση της ινωδόλυσης. Μέσω της δράσης αυτής είναι πιθανό να αποτελεί ένα ρυθμιστή της ισορροπίας μεταξύ της πήξης και της ινωδόλυσης, ενώ τα υψηλά επίπεδά του μπορεί να θεωρηθεί ότι δημιουργούν συνθήκες υποϊνωδόλυσης. Τα επίπεδα του αντιγόνου του TAFI στο πλάσμα φαίνεται να παρουσιάζουν μεγάλη μεταβλητότητα μεταξύ των υγιών, γεγονός το οποίο μπορεί να αποδοθεί στη γενετική επίδραση πολυμορφισμών του γονιδίου του TAFI (CPB2 gene), ενώ από μελέτες σε ασθενείς με φλεβική και αρτηριακή θρόμβωση προκύπτει συσχέτιση των πολυμορφισμών με τα επίπεδα του αντιγόνου του TAFI και με τον κίνδυνο για θρόμβωση. Στην παρούσα μελέτη εξετάσθηκαν πέντε πολυμορφισμοί του TAFI (C-2599G, G-438A, Ala147Thr, C+1542G, T+1583A) σε ασθενείς με θρόμβωση οφθαλμικών αγγείων (φλεβών και αρτηριών). Οι πολυμορφισμοί C-2599G, C+1542G και T+1583A προσδιορίστηκαν με χρήση ειδικής για το αλλήλιο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Allele Specific PCR) , ενώ για τους πολυμορφισμούς G-438A και Ala147Thr έγινε προσδιορισμός με ανάλυση βασισμένη σε PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP). Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της συχνότητας των αλληλίων των υπό μελέτη πολυμορφισμών στους ασθενείς της μελέτης με τις αντίστοιχες συχνότητες σε λευκούς Ευρωπαίους, όπως αυτές προέκυψαν από την μελέτη Frere et al. και της συχνότητας των γονοτύπων των υπό μελέτη πολυμορφισμών στους ασθενείς τις μελέτης με τις αντίστοιχες συχνότητες, όπως αυτές προέκυψαν στο σύνολο του πληθυσμού της μελέτης PRIME. Στο σύνολο των ασθενών, διαπιστώθηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό μικρότερη συχνότητα του γονοτύπου +1542CC (διαφορά 49%, 95%CI: 31,9% to 56,2%, P<0,0001), ο οποίος σχετίζεται με υψηλά επίπεδα TAFI πλάσματος, και μεγαλύτερη συχνότητα του γονοτύπου -438ΑΑ (διαφορά 15%, 95%CI:-2,6% to 50,6%, P=0,03), ο οποίος έχει συσχετισθεί με χαμηλά επίπεδα TAFI πλάσματος. Στους ασθενείς με φλεβική θρόμβωση του οφθαλμού διαπιστώθηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό μικρότερη συχνότητα του γονοτύπου +1542CC (διαφορά 44%, 95%CI: 19,5% to 55,1%, P=0,0003), ο οποίος σχετίζεται με υψηλά επίπεδα TAFI πλάσματος, ενώ για τους ασθενείς με αρτηριακή θρόμβωση του οφθαλμού διαπιστώθηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό αυξημένη συχνότητα του γονοτύπου +2599CC - συσχέτιση με αυξημένα επίπεδα TAFI πλάσματος - (διαφορά 30%, 95%CI: 3,1% to 65,9%, P=0,0076), αυξημένη συχνότητα του γονοτύπου -438ΑΑ - συσχέτιση με ελαττωμένα επίπεδα TAFI πλάσματος- (διαφορά 35%, 95%CI: 0,2% to 80,4%, P=0,0005), ελαττωμένη συχνότητα του γονοτύπου +1542CC -συσχέτιση με αυξημένα επίπεδα TAFI πλάσματος - και ελαττωμένη συχνότητα του γονοτύπου +1542CC -συσχέτιση με αυξημένα επίπεδα TAFI- (διαφορά 56%, 95%CI: 24,9% to 59,6%, P=0,0004). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στις συχνότητες των αλληλίων και των γονοτύπων των υπό μελέτη πολυμορφισμών σε σύγκριση μεταξύ των ομάδων με αρτηριακή και φλεβική θρόμβωση του οφθαλμού. Από την παρούσα μελέτη προέκυψε ότι ο μόνος γονότυπος, ο οποίος έχει συσχετισθεί με υψηλά επίπεδα TAFI πλάσματος και επομένως πιθανά αυξημένο κίνδυνο για θρόμβωση, που βρέθηκε σε αυξημένη συχνότητα ήταν ο +2599CC στην ομάδα των ασθενών με αρτηριακή θρόμβωση του οφθαλμού. Λόγω του μικρού αριθμού των ασθενών της μελέτης (n=33) και τη σύγκριση με δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας , για την ασφαλή τεκμηρίωση των ανωτέρω παρατηρήσεων κρίνεται σκόπιμη η ανάλυση μεγαλύτερου δείγματος ασθενών με θρόμβωση των οφθαλμικών αγγείων, η σύγκριση με αντίστοιχο πληθυσμό υγιών μαρτύρων, καθώς και πιθανά η μέτρηση των επιπέδων του αντιγόνου του TAFI στους ασθενείς αυτούς, ώστε να γίνει καλύτερα κατανοητή η συμμετοχή ή όχι του TAFI ως αιτιοπαθογενετικού παράγοντα στις θρομβώσεις της οφθαλμικής κυκλοφορίας.Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) is an enzyme with carboxypeptidase activity that connects the pathways of coagulation and fibrinolysis. It acts by cleaving the C-terminal residues of fibrin, thus prohibiting the binding of plasminogen and plasminogen activator to fibrin and as a consequence leading to downregulation of fibrinolysis. Due to this action it is possible that TAFI regulates the balance between coagulation and fibrinolysis, while high TAFI levels can be considered to create a state of hypofibrinolysis. TAFI antigen plasma levels seem to have great variability among the healthy population, a fact that can be attributed to the genetic influence of TAFI gene (CPB2) polymorphisms. Studies including patients with venous and arterial thrombosis show a connection between TAFI polymorhisms, its plasma levels and the risk for thrombosis. In this study five TAFI gene polymorphisms (C-2599G, G-438A, Ala147Thr, C+1542G, T+1583A) have been analyzed in patients with ocular thrombosis (venous and arterial). Allele specific polymerase chain reaction (ASPCR) analysis was performed for C-2599G, C+1542G and T+1583A polymoprhisms and polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism based analysis (PCR-RFLP) was performed for G-438A and Ala147Thr polymorphisms. The results of the study regarding the allele frequency of the polymorphisms were compared to the corresponding frequency in white Europeans based on the Frere et al. study and the results of the study regarding the genotype frequency of the polymorphisms were compared to the corresponding frequency in the PRIME study population. When it comes to the whole study population there was a statistically significant lower frequency for the +1542CC genotype (difference 49%, 95%CI: 31,9% to 56,2%, P<0,0001), that has been correlated with high TAFI plasma levels, and a higher frequency of the -438AA genotype (difference 15%, 95%CI:-2,6% to 50,6%, P=0,03), that has been correlated with low TAFI plasma levels. In patients with ocular venous thrombosis there was a statistically significant lower frequency of the +1542CC genotype (difference 44%, 95%CI: 19,5% to 55,1%, P=0,0003), that has been correlated with high TAFI plasma levels, while in patients with ocular arterial thrombosis there was a statistically significant higher frequency of the +2599CC genotype - correlation with high with high TAFI plasma levels - (difference 30%, 95%CI: 3,1% to 65,9%, P=0,0076), higher frequency of the -438AAgenotype - correlation with low TAFI plasma levels - (difference 35%, 95%CI: 0,2% to 80,4%, P=0,0005), lower frequency of the +1542CC genotype -correlation with high TAFI plasma levels - (difference 56%, 95%CI: 24,9% to 59,6%, P=0,0004). There was no statistically significant difference of the allele and genotype frequency in the comparison between the patients with ocular venous thrombosis and ocular arterial thrombosis. From the present study we conclude that the only genotype that has been associated with high TAFI plasma levels and therefore with possible higher risk for thrombosis was +2599CC in the group of patients with ocular arterial thrombosis. Due to the low number of patients in this study (n=33) and the comparison to data from other published studies, in order to safely prove the above conclusions, it is necessary to study more patients with ocular thrombosis, to compare them with a corresponding population of healthy controls and possibly determine the TAFI plasma levels in these patients, so that we can better comprehend the involvement of TAFI as a causative factor in the ocular circulation thrombosis

Autophagy in myelodysplastic syndromes: the role of HIF-1a/REDD1 molecular pathway

Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of clonal hematopoietic stem (HSCs) and/or progenitor cells (HPCs) disorders. The established dependence of MDS progenitors on the hypoxic bone marrow (BM) microenvironment turned scientific interests to the transcription factor Hypoxia-Inducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 facilitates quiescence maintenance and regulates differentiation by manipulating HSCs metabolism, being thus an appealing research target.In the first section of the study, we examine the aberrant HIF-1 stabilization in BMs from MDS patients.Methods: BΜ aspiration samples, as well as BM biopsies, were collected from 16 newly diagnosed previously untreated MDS patients and 7 controls with non-malignant hematologic disorder. qRT-PCR and flow cytometry analysis were respectively used for the assessment of mRNA and protein levels of HIF-1α and HIF-1 direct transcriptional target, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1), in BM aspiration samples A nitroimidazole-indocyanine conjugate was used for the study of the hypoxic phenotype in BM biopsies, as well as in cultured CD34+ BM cells. Autophagy and mitophagy were examined by means of immunofluorescence and electron microscopy. We finally performed in vitro cultures of human BM derived CD34+ HSCs under myeloid priming using a functional HIF-1α inhibitor.Results: We show that HIF-1 aberrant expression and transcription activity is oxygen independent establishing the phenomenon of pseudohypoxia in MDS BM. Next, we examine mitochondrial quality and quantity along with levels of autophagy in the differentiating myeloid lineage isolated from fresh BM MDS and control aspirates given that both phenomena are HIF-1 dependent. We show that mitophagy of abnormal mitochondria and autophagic death are prominently featured in the MDS myeloid lineage, their severity increasing with intra-BM blast counts. Finally, we use in vitro cultured CD34+ HSCs isolated from fresh human BM aspirates to manipulate HIF-1 expression and examine its potential as a therapeutic target. We find that despite cultured under 21% O2, HIF-1 remained aberrantly stable in all MDS cultures. Inhibition of HIF-1α subunit had a variable beneficial effect in all 5%-intra-BM blasts-MDS that uniformly died within 3 days of culture.Conclusions: We conclude that HIF-1 and pseudohypoxia are prominently featured in MDS pathobiology and their manipulation has some potential in the therapeutics of benign MDS.In the second section of the study, we examine the different metabolic profile of MDS myeloid lineage with low and high BM blast percentage.Methods: We performed an untargeted metabolomic analysis of differentiating myeloid lineage cells from MDS BM aspirates that exhibited <5% (G1) or ≥5% (G2) blasts, in order to delineate its role in MDS severity and malignant potential. BM aspirates were collected from 14 previously untreated MDS patients (G1, n = 10 and G2, n = 4) and age matched controls (n = 5). Following myeloid lineage cell isolation, untargeted mass spectrometry-based metabolomics analysis was performed. Data were processed and analyzed using Metabokit. Enrichment analysis was performed using Metaboanalyst v4 employing pathway-associated metabolite sets.25Results: We established a bioenergetic profile coordinated by the Warburg phenomenon in both groups, but with a massively different outcome that mainly depended upon each group mitochondrial function and redox state. G1 cells are overwhelmed by glycolytic intermediate accumulation due to failing mitochondria, while the functional electron transport chain and improved redox in G2 compensate for Warburg disruption. Both metabolomes reveal the production and abundance of epigenetic modifiers. G1 and G2 metabolomes differ and eventually determine the MDS clinical phenotype, as well as the potential for malignant transformation.Conclusion: Our findings suggest that a perturbed metabolism underlies the syndrome’s pathogenesis and also determines the disease severity. We also propose that these bioenergetic alterations are essentially featured in and indeed drive the process of leukemic transformation. Our data not only offer novel insight into the elusive MDS pathophysiology, but also change our viewpoint on MDS-related acute myeloid leukemia biology.Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα κλωνικών διαταραχών των αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων (Hematopoietic Stem Cells – HSCs) ή προγονικών κυττάρων (Hematopoietic Progenitor Cells – HPCs). Η τεκμηριωμένη εξάρτηση των προγονικών κυττάρων των ΜΔΣ από το υποξικό περιβάλλον του μυελού των οστών (ΜΟ) έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στον επαγόμενο από την υποξία μεταγραφικό παράγοντα 1 (Hypoxia Inducible Factor 1 – HIF-1). Ο HIF-1 διαμεσολαβεί τη διατήρηση της ηρεμίας και ρυθμίζει τη διαφοροποίηση τροποποιώντας το μεταβολισμό των HSCs, αποτελώντας έτσι έναν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο.Στο πρώτο τμήμα της παρούσας μελέτης, διερευνήθηκε η παθολογική σταθεροποίηση του HIF-1 στο ΜΟ ασθενών με ΜΔΣ.Μέθοδοι: Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ και οστεομυελικές βιοψίες συλλέχθηκαν από 16 ασθενείς με πρωτοδιάγνωση ΜΔΣ και από 7 μάρτυρες χωρίς κακοήθη αιματολογική διαταραχή. Μελέτη με qRT-PCR και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε αντίστοιχα για την εκτίμηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του HIF-1α και του άμεσου μεταγραφικού στόχου του HIF-1, regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) σε δείγματα αναρρόφησης ΜΟ. Η αυτοφαγία και η μιτοφαγία μελετήθηκαν με ανοσοφθορισμό και παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs ΜΟ με κατεύθυνση διαφοροποίησης προς μυελική σειρά με τη χρήση ενός λειτουργικού αναστολέα του HIF-1α.Αποτελέσματα: Δείξαμε ότι η παθολογική έκφραση και μεταγραφική δραστηριότητα του HIF-1α είναι ανεξάρτητη από το οξυγόνο τεκμηριώνοντας το φαινόμενο της ψευδοϋποξίας στο ΜΟ των ΜΔΣ. Ακολούθως, μελετήσαμε την ποιότητα και την ποσότητα των μιτοχονδρίων παράλληλα με τα επίπεδα αυτοφαγίας στα διαφοροποιούμενα κύτταρα της μυελικής σειράς μετά την απομόνωση από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ, δεδομένου ότι και τα δύο φαινόμενα είναι εξαρτώμενα από τον HIF-1. Δείξαμε ότι η μιτοφαγία των παθολογικών μιτοχονδρίων και ο αυτοφαγικός θάνατος αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της μυελικής σειράς των ΜΔΣ, με τη βαρύτητά τους να αυξάνεται με το ποσοστό των βλαστών του ΜΟ. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε in vitro καλλιέργειες CD34+ HSCs απομονωμένων από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ προκειμένου να επηρεάσομε την έκφραση του HIF-1 και να μελετήσουμε το δυναμικό του ως θεραπευτικού στόχου. Διαπιστώσαμε ότι παρότι οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε παροχή οξυγόνου 21%, ο HIF-1 παρέμενε παθολογικά σταθερός σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ. Η αναστολή του HIF-1α είχε διαφορετικού βαθμού θετική επίδραση σε όλες τις καλλιέργειες των ΜΔΣ με < 5% βλάστες, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στις καλλιέργειες των ΜΔΣ με ≥5% βλάστες, οι οποίες δεν επιβίωναν μετά την τρίτη μέρα της καλλιέργειας.Συμπεράσματα: Συμπεραίνουμε ότι ο HIF-1 και η ψευδοϋποξία αποτελούν κυρίαρχο χαρακτηριστικό της παθοφυσιολογίας των ΜΔΣ και η επίδραση επί αυτών μπορεί να έχει κάποιο δυναμικό στη θεραπευτική των ήπιων ΜΔΣ.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, διερευνήσαμε τα διαφορετικά μεταβολικά προφίλ της μυελικής σειράς ΜΔΣ με χαμηλά και υψηλά ποσοστά βλαστών.Μέθοδοι: Πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση των διαφοροποιούμενων κυττάρων της μυελικής σειράς από δείγματα αναρρόφησης ΜΟ23ασθενών με ΜΔΣ με <5% (G1) ή ≥5% (G2) βλάστες, με στόχο να διερευνήσουμε το ρόλο του μεταβολισμού στη βαρύτητα και το κακόηθες δυναμικό των ΜΔΣ. Δείγματα αναρρόφησης ΜΟ συλλέχθηκαν από 14 ασθενείς με ΜΔΣ, οι οποίοι δεν είχαν λάβει θεραπεία (G1, n=10 και G2, n=4) και από αντίστοιχης ηλικίας μάρτυρες (n=5). Μετά από απομόνωση των κυττάρων της μυελικής σειράς, πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση. Η επεξεργασία και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το Metabokit. Η ανάλυση εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Metaboanalyst v4 με εφαρμογή σχετιζόμενων με μονοπάτια ομάδων μεταβολιτών.Αποτελέσματα: Τεκμηριώσαμε ένα βιοενεργητικό προφίλ που συντονίζεται από το φαινόμενο Warburg και στις δύο ομάδες, με σημαντικά διαφορετικό αποτέλεσμα που εξαρτάται από τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και την οξειδοαναγωγική κατάσταση κάθε ομάδας. Τα κύτταρα της ομάδας G1 παρουσιάζουν συσσώρευση ενδιάμεσων μεταβολιτών της γλυκόλυσης λόγω δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων, ενώ η λειτουργική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και η βελτιωμένη οξειδοαναγωγή της ομάδας G2 εξισορροπεί τη διαταραχή Warburg. Το μεταβόλομα και των δύο ομάδων παρουσιάζει αφθονία επιγενετικών τροποποιητών. Το μεταβόλομα της ομάδας G1 και G2 διαφέρει και τελικά καθορίζει τον κλινικό φαινότυπο του ΜΔΣ, καθώς και το δυναμικό για κακοήθη μετατροπή.Συμπέρασμα: Τα ευρήματά μας προτείνουν ότι ο διαταραγμένος μεταβολισμός συμμετέχει στην παθογένεση του συνδρόμου και καθορίζει επίσης τη βαρύτητα της νόσου. Προτείνουμε επίσης ότι αυτές οι βιοενεργητικές μεταβολές χαρακτηρίζουν και οδηγούν τη λευχαιμική μετατροπή. Τα δεδομένα μας δεν παρέχουν απλά μια νέα θεώρηση στην παθοφυσιολογία των ΜΔΣ, αλλά τροποποιούν και την επικρατούσα άποψη για τη βιολογία της σχετιζόμενης με ΜΔΣ ΟΜΛ

Autophagy and Metabolism in Normal and Malignant Hematopoiesis

The hematopoietic system relies on regulation of both metabolism and autophagy to maintain its homeostasis, ensuring the self-renewal and multipotent differentiation potential of hematopoietic stem cells (HSCs). HSCs display a distinct metabolic profile from that of their differentiated progeny, while metabolic rewiring from glycolysis to oxidative phosphorylation (OXPHOS) has been shown to be crucial for effective hematopoietic differentiation. Autophagy-mediated regulation of metabolism modulates the distinct characteristics of quiescent and differentiating hematopoietic cells. In particular, mitophagy determines the cellular mitochondrial content, thus modifying the level of OXPHOS at the different differentiation stages of hematopoietic cells, while, at the same time, it ensures the building blocks and energy for differentiation. Aberrations in both the metabolic status and regulation of the autophagic machinery are implicated in the development of hematologic malignancies, especially in leukemogenesis. In this review, we aim to investigate the role of metabolism and autophagy, as well as their interconnections, in normal and malignant hematopoiesis

Pathogenetic Mechanisms Implicated in Sjögren’s Syndrome Lymphomagenesis: A Review of the Literature

Sj&ouml;gren&rsquo;s Syndrome (SS) is a chronic autoimmune disorder characterized by focal mononuclear cell infiltrates that surround the ducts of the exocrine glands, impairing the function of their secretory units. Compared to other autoimmune disorders, SS is associated with a notably high incidence of non-Hodgkin lymphoma (NHL) and more frequently mucosa associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma, leading to increased morbidity and mortality rates. High risk features of lymphoma development include systemic extraepithelial manifestations, low serum levels of complement component C4 and mixed type II cryoglobulinemia. The discrimination between reactive and neoplastic lymphoepithelial lesion (LEL) is challenging, probably reflecting a continuum in the evolution from purely inflammatory lymphoid infiltration to the clonal neoplastic evolution. Early lesions display a predominance of activated T cells, while B cells prevail in severe histologic lesions. This strong B cell infiltration is not only a morphologic phenomenon, but it is also progressively associated with the presence of ectopic germinal centers (GCs). Ectopic formation of GCs in SS represents a complex process regulated by an array of cytokines, adhesion molecules and chemokines. Chronic antigenic stimulation is the major driver of specific B cell proliferation and increases the frequency of their transformation in the ectopic GCs and marginal zone (MZ) equivalents. B cells expressing cell surface rheumatoid factor (RF) are frequently detected in the salivary glands, suggesting that clonal expansion might arise from antigen selection of RF-expressing B cells. Abnormal stimulation and incomplete control mechanisms within ectopic lymphoid structures predispose RF MZ like cells to lymphoma development. Immunoglobulin recombination, somatic mutation and isotype switching during B cell development are events that may increase the translocation of oncogenes to immunoglobulin loci or tumor suppressor gene inactivation, leading to monoclonal B cell proliferation and lymphoma development. Concerning chronic antigenic stimulation, conclusive data is so far lacking. However immune complexes containing DNA or RNA are the most likely candidates. Whether additional molecular oncogenic events contribute to the malignant overgrowth remains to be proved

Can Exercise-Induced Muscle Damage Be a Good Model for the Investigation of the Anti-Inflammatory Properties of Diet in Humans?

Subclinical, low-grade, inflammation is one of the main pathophysiological mechanisms underlying the majority of chronic and non-communicable diseases. Several methodological approaches have been applied for the assessment of the anti-inflammatory properties of nutrition, however, their impact in human body remains uncertain, because of the fact that the majority of the studies reporting anti-inflammatory effect of dietary patterns, have been performed under laboratory settings and/or in animal models. Thus, the extrapolation of these results to humans is risky. It is therefore obvious that the development of an inflammatory model in humans, by which we could induce inflammatory responses to humans in a regulated, specific, and non-harmful way, could greatly facilitate the estimation of the anti-inflammatory properties of diet in a more physiological way and mechanistically relevant way. We believe that exercise-induced muscle damage (EIMD) could serve as such a model, either in studies investigating the homeostatic responses of individuals under inflammatory stimuli or for the estimation of the anti-inflammatory or pro-inflammatory potential of dietary patterns, foods, supplements, nutrients, or phytochemicals. Thus, in this review we discuss the possibility of exercise-induced muscle damage being an inflammation model suitable for the assessment of the anti-inflammatory properties of diet in humans