Polytetrafluoroethylene 樹脂表面上での細胞観察手法の開発および血中分子の及ぼす影響

【緒論】　Polytetrafluoroethylene（PTFE）はフッ素樹脂の一種であり、生体適合性、化学的安定性、抗細胞接着性の高さから、血液接触型の医療機器に広く使用されている。人工血管においてもPTFEは使用されており、血栓形成の抑制のために、血小板付着抑制や血管内皮細胞による血管内壁の裏打ち（内皮化）の研究が行われている。PTFE製人工血管への長期にわたる抗血栓性付与には、血管内皮細胞の接着の安定性が重要である。その評価には、経日的な観察が必要であり、その解析には位相差顕微鏡による観察が適している。しかしながら、PTFEは光透過率と機械的強度がともに低いため、実験に十分な強度の厚さでは光透過率が不十分であり位相差顕微鏡による観察ができない。一方、薄膜であれば位相差観察は可能であると予測されるが、機械的強度が不十分となり、実験に用いるのは困難である。このため、PTFE表面の細胞の経日的観察の報告、特に血液との接触を想定した基礎的な報告はほとんどない。　本研究は2章から構成されている。第1章では培養下においてPTFE表面の細胞の位相差観察を可能にするため、後述のPTFEコートガラスを開発し、PTFE表面の細胞を可視化できることを示した。第2章では、開発したPTFEコートガラスを用いて、血液との接触を想定して内皮細胞を経日的に観察し、血中分子と細胞外マトリクスを介した接着を評価した。第1章：PTFE表面の細胞の可視化【背景と目的】　PTFE表面には細胞が直接接着することがほとんどないものの、血漿を介することで接着が可能になることが報告されている。PTFEは光透過率が低いため、位相差顕微鏡による生細胞の観察ができず、固定、染色した後に観察が行われている。　本章では、カバーガラス上に薄膜のPTFEコーティングを施したPTFEコートガラスを開発することで、PTFE表面の生細胞の位相差顕微鏡観察を可能にすることを目的とした。【材料と方法】　PTFEコートガラスと一般的なPTFE樹脂（PTFEブロック）で細胞接着の低さの同等性を評価するために、ラット大動脈血管内皮細胞（RAOEC）を播種し、24時間後の接着細胞数をWST-8 Assayで測定した。　血漿を介した細胞接着もPTFEコートガラスとPTFEブロックで同等であるか評価するために、PTFEコートガラスとPTFEブロックをラット血漿に一昼夜浸漬した後、ラット大動脈血管内皮細胞（RAOEC）を播種し、24時間後の接着細胞数をWST-8 Assayで測定した。血漿を介してPTFE表面に接着した細胞の観察には、倒立型位相差顕微鏡を用いた。【結果と考察】　PTFEコートガラスにはPTFEブロックと同様に、RAOECがほとんど接着しないことが示された。また、PTFEコートガラスにはPTFEブロックと同様に血漿処理によりRAOECが接着可能になった。この接着した細胞はPTFEコートガラスにおいてのみ位相差観察が可能であった。また、PTFEコートガラス表面には、実験中に大きな傷や剥離は確認されなかった。これらのことから、PTFEコートガラスは位相差顕微鏡観察に十分な光透過率と機械的強度を持つことが示された。【結論】　これまでPTFE表面の細胞を観察するためには、固定や染色が必要であったが、PTFEコートガラスを用いることでPTFE表面の位相差顕微鏡による培養下での生細胞観察が可能になった。第2章：血中分子と細胞外マトリクスを介したPTFEへの細胞接着の評価2-1：PTFEへの細胞接着の短期的解析【背景と目的】　安定した細胞の接着の指標の一つとして、細胞が仮足を広げているかどうかが挙げられる。しかし、PTFE表面は位相差顕微鏡観察が困難であるため、接着細胞の形態評価はほとんど行われていない。PTFEコートガラスを用いることで、細胞仮足の位相差観察が容易に行え、細胞接着の安定性を評価することが可能である。　そこで、第1章で示した血漿を介した細胞接着が接着分子特異的か、また、どの接着分子がPTFE表面への細胞接着を促進するか解析した。同時に、これらの接着分子がPTFE表面への血小板接着に及ぼす影響を解析することで、血小板接着を促進せずに内皮化を促進する物質を探索することを目的とした。【材料と方法】　血漿を介した細胞接着が接着分子特異的か解析するために、血漿処理PTFEコートガラスに、広範囲な接着分子阻害ペプチドであるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（RGDS）で処理したRAOECを播種し、24時間後に位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで細胞接着を解析した。　接着分子であるフィブロネクチン、ヴィトロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、コラーゲンの細胞接着への影響を評価するために、PTFEコートガラスをこれらの接着分子で前章と同様に処理し、RAOECを播種し、24時間後の接着を位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで評価した。また、同様にラット血小板を播種し90分後の接着を乳酸脱水素酵素（LDH）Assayで評価した。　フィブリノゲンの細胞接着への影響を解析するために、PTFEコートガラスを前章と同様に血漿もしくは血清で処理し、RAOECを播種し、24時間後の接着を位相差顕微鏡観察およびWST-8 Assayで評価した。また、ラット血小板を播種し、90分後の接着を乳酸脱水素酵素（LDH）Assayで評価した。【結果と考察】　血漿処理PTFEコートガラス表面の、RGDS処理されたRAOECを位相差顕微鏡観察した結果、仮足を広げない不安定な接着が確認された。この細胞接着をWST-8 Assayで評価すると、RGDSにより抑制される傾向が示された。　接着分子で処理したPTFEコートガラス表面のRAOECを位相差顕微鏡観察した結果、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン処理においてRAOECの仮足を広げた安定な接着が確認された。このときの細胞接着をWST-8 Assayで評価すると、フィブロネクチン処理が最も高い細胞接着を示し、次いでラミニンとコラーゲン処理が比較的高い細胞接着を示した。また、血小板の接着ではフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン処理が抑制傾向を示し、フィブリノゲン処理は促進傾向を示した。【結論】　PTFEへの血漿を介したRAOECの接着は接着分子特異的であることが示唆され、接着分子のうちフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンがPTFEへの細胞接着を誘導することが示された。2-2：PTFEへの細胞接着の経日的解析【背景と目的】　2-1より血漿、フィブロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲン処理されたPTFE表面において、播種24時間後では仮足を広げた細胞接着が確認された。人工血管の内皮化には、これらの接着がより長期間にわたり安定であり、その表面で細胞増殖が可能であることが重要である。　このため、これらの処理をされたPTFE表面の細胞接着の安定性および増殖を経日的に評価することで、人工血管の内皮化に有用な分子を探索することを目的とした。【材料と方法】　血漿、フィブロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲンで前章と同様にPTFEコートガラスを処理し、RAOECを播種し、経日的に位相差顕微鏡により観察し、細胞接着の安定性および増殖を評価した。【結果と考察】　フィブロネクチンおよびラミニン処理したPTFE表面へのRAOECの接着は安定的であり、細胞増殖もみられ、PTFE表面の内皮化が可能であった。血漿およびコラーゲンもPTFE表面への細胞接着を誘導したが、この接着は不安定であり、播種7日以内にほとんどの内皮細胞が剥離し、内皮化は起こらなかった。フィブロネクチンやラミニンが、PTFE表面における細胞接着の安定性や細胞増殖を促進することが示されたことから、これらの処理をPTFE製人工血管にも施すことで、安定な内皮化を引き起こすことが可能になると予測された。一方、血漿処理後のPTFE表面には細胞が接着するものの、不安定であり数日で接着細胞が認められなくなった。移植されたPTFE製人工血管においても、血液を介した細胞接着は不安定であり、内皮化が起こりにくいと予測された。【結論】　本実験でPTFE表面へのフィブロネクチンやラミニン処理が、安定な細胞接着を引き起こし、内皮化を可能にすることが示された。また、血漿で処理されたPTFE表面は細胞接着が不安定であり、内皮化が困難であることが示唆された。【総括】　本研究では、カバーガラスにPTFEをコーティングしたPTFEコートガラスを開発し、これまで困難であったPTFE表面の位相差顕微鏡観察を可能にした（第1章）。位相差顕微鏡を用いて、PTFEコートガラス表面のRAOECを経日的に観察した。血漿処理されたPTFE表面では、播種7日後にはほとんどの細胞がPTFE表面から剥離した。このことから、移植されたPTFE製人工血管では、その表面に血中の接着分子を介して細胞が接着するが、不安定であるため内皮化の速度が遅くなると予測された（第2章）。　研究によりPTFE表面の細胞観察が容易となったため、細胞の接着安定性等を評価することで、人工血管をはじめとするPTFE製の医療機器の改良に繋がると考えられる。Polytetrafluoroethylene (PTFE), a kind of fluoropolymer, is widely used as a biomaterial for blood-contacting medical devices because of its properties, such as good biocompatibility, chemical stability and anti-cellular adhesiveness. In blood vessel prostheses, the anti-platelets adhesiveness and endothelialization on the surface of PTFE have been studied for the suppression of thrombus formation. Especially, the endothelialization plays an important role for the longstanding suppression of thrombus formation, the stability of the endothelial adhesiveness on the PTFE is important for that. Inverted phase-contrast microscopy is suitable for the chronological observation, which is needed to estimate the stability of the cellular adhesiveness on the PTFE. However, it is difficult to observe on the surface of thick PTFE, which have sufficient mechanical strength for use in biological experiments, by inverted phase-contrast microscopy because of its low optical transmittance. Although a thin layer of PTFE is likely to have low optical transmittance sufficient for observation under an inverted phase-contrast microscope such a thin layer would have insufficient mechanical strength. In the present study, we developed a PTFE-coated glass with optical transmittance sufficient for observation under an inverted phase-contrast microscope but with sufficient mechanical strength for use in biological experiments. The purpose of this thesis is that the observation of cells under an inverted phase-contrast microscope and the analysis of the effect of blood molecules on the cell adhesion on the surface of PTFE by using the PTFE-coated glass. The background of this thesis was explained in the first chapter. The PTFE-coated glass, which was made by the PTFE coating on the cover glass, was developed to achieve these opposite properties, the optical transmittance and mechanical strength, in the second chapter. Rat aortic endothelial cells (RAOECs) were seeded on the PTFE-coated glass treated with plasma that achieves the cell adhesion to PTFE. The observation of RAOECs on the PTFE-coated glass was tried by using an inverted phase-contras microscope and an inverted fluorescence microscope. It was possible to observe RAOECs on the surface of the PTFE-coated glass by using these microscopes. Any recognizable damage or peeling was recognized in the present study. These results showed that the PTFE-coated glass has sufficient strength and transmittance to be used for biological experiments. The PTFE-coated glass enabled live-cell observation of the PTFE surface using a phase-contrast microscope and also chronological observation. We estimated the effects of the blood molecules and extra cellular matrix on the RAOECs adhesion to PTFE, in third chapter. RAOECs or platelets were seeded on the PTFE-coated glass, which was treated with plasma, serum or cell adhesion molecules contained in blood and extra cellular matrix. The estimation of morphology and adhesion of RAOECs and platelets on the PTFE surface showed that treatment with the fibronectin, laminin, collagen, plasma and serum enhanced the cell adhesion, and tended to suppress the platelets adhesion. The chronological observation of RAOECs on the PTFE-coated glass treated with the fibronectin, laminin, collagen or plasma was performed by using phase-contrast microscopy. RAOECs stably adhered, proliferated, and covered the PTFE surface within 3 days by treatment with fibronectin and laminin. The plasma and collagen also enhanced the cell adhesion to the PTFE surface, however most RAOECs were detached within 7 days. These results suggested that RAOECs unsteadily adhere to the PTFE synthetic graft implanted via blood molecules, the speed of endothelialization of the graft is delayed by the detachment of the endothelial cells from that. It was suggested that the treatment with the fibronectin and laminin suppress the thrombus of the PTFE synthetic graft implanted by both the rapid endothelialization caused by the stably adhesion of endothelial cells and the suppression of the platelets adhesion.博士(学術)麻布大

Low immunogenicity of LNP allows repeated administrations of CRISPR-Cas9 mRNA into skeletal muscle in mice

筋ジストロフィーのゲノム編集治療を目指したLNP-mRNA輸送システムの開発. 京都大学プレスリリース. 2021-12-08.Nanotechnology for genome editing in multiple muscles simultaneously. 京都大学プレスリリース. 2021-12-08.Genome editing therapy for Duchenne muscular dystrophy (DMD) holds great promise, however, one major obstacle is delivery of the CRISPR-Cas9/sgRNA system to skeletal muscle tissues. In general, AAV vectors are used for in vivo delivery, but AAV injections cannot be repeated because of neutralization antibodies. Here we report a chemically defined lipid nanoparticle (LNP) system which is able to deliver Cas9 mRNA and sgRNA into skeletal muscle by repeated intramuscular injections. Although the expressions of Cas9 protein and sgRNA were transient, our LNP system could induce stable genomic exon skipping and restore dystrophin protein in a DMD mouse model that harbors a humanized exon sequence. Furthermore, administration of our LNP via limb perfusion method enables to target multiple muscle groups. The repeated administration and low immunogenicity of our LNP system are promising features for a delivery vehicle of CRISPR-Cas9 to treat skeletal muscle disorders

Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping

Prolonged expression of the CRISPR-Cas9 nuclease and gRNA from viral vectors may cause off-target mutagenesis and immunogenicity. Thus, a transient delivery system is needed for therapeutic genome editing applications. Here, we develop an extracellular nanovesicle-based ribonucleoprotein delivery system named NanoMEDIC by utilizing two distinct homing mechanisms. Chemical induced dimerization recruits Cas9 protein into extracellular nanovesicles, and then a viral RNA packaging signal and two self-cleaving riboswitches tether and release sgRNA into nanovesicles. We demonstrate efficient genome editing in various hard-to-transfect cell types, including human induced pluripotent stem (iPS) cells, neurons, and myoblasts. NanoMEDIC also achieves over 90% exon skipping efficiencies in skeletal muscle cells derived from Duchenne muscular dystrophy (DMD) patient iPS cells. Finally, single intramuscular injection of NanoMEDIC induces permanent genomic exon skipping in a luciferase reporter mouse and in mdx mice, indicating its utility for in vivo genome editing therapy of DMD and beyond

Human Transcription Elongation Factor NELF: Identification of Novel Subunits and Reconstitution of the Functionally Active Complex

The multisubunit transcription elongation factor NELF (for negative elongation factor) acts together with DRB (5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole) sensitivity-inducing factor (DSIF)/human Spt4-Spt5 to cause transcriptional pausing of RNA polymerase II (RNAPII). NELF activity is associated with five polypeptides, A to E. NELF-A has sequence similarity to hepatitis delta antigen (HDAg), the viral protein that binds to and activates RNAPII, whereas NELF-E is an RNA-binding protein whose RNA-binding activity is critical for NELF function. To understand the interactions of DSIF, NELF, and RNAPII at a molecular level, we identified the B, C, and D proteins of human NELF. NELF-B is identical to COBRA1, recently reported to associate with the product of breast cancer susceptibility gene BRCA1. NELF-C and NELF-D are highly related or identical to the protein called TH1, of unknown function. NELF-B and NELF-C or NELF-D are integral subunits that bring NELF-A and NELF-E together, and coexpression of these four proteins in insect cells resulted in the reconstitution of functionally active NELF. Detailed analyses using mutated recombinant complexes indicated that the small region of NELF-A with similarity to HDAg is critical for RNAPII binding and for transcriptional pausing. This study defines several important protein-protein interactions and opens the way for understanding the mechanism of DSIF- and NELF-induced transcriptional pausing

Genetic and Phenotypic Characterization of a Rabies Virus Strain Isolated from a Dog in Tokyo, Japan in the 1940s

The rabies virus strain Komatsugawa (Koma), which was isolated from a dog in Tokyo in the 1940s before eradication of rabies in Japan in 1957, is known as the only existent Japanese field strain (street strain). Although this strain potentially provides a useful model to study rabies pathogenesis, little is known about its genetic and phenotypic properties. Notably, this strain underwent serial passages in rodents after isolation, indicating the possibility that it may have lost biological characteristics as a street strain. In this study, to evaluate the utility of the Koma strain for studying rabies pathogenesis, we examined the genetic properties and in vitro and in vivo phenotypes. Genome-wide genetic analyses showed that, consistent with previous findings from partial sequence analyses, the Koma strain is closely related to a Russian street strain within the Arctic-related phylogenetic clade. Phenotypic examinations in vitro revealed that the Koma strain and the representative street strains are less neurotropic than the laboratory strains. Examination by using a mouse model demonstrated that the Koma strain and the street strains are more neuroinvasive than the laboratory strains. These findings indicate that the Koma strain retains phenotypes similar to those of street strains, and is therefore useful for studying rabies pathogenesis

Effect of Annealing on Crystal and Local Structures of Doped Zirconia Using Experimental and Computational Methods

The effects of the annealing process on the crystal and local structures of doped zirconia were investigated by Rietveld refinements of synchrotron X-ray and neutron diffraction, the maximum entropy method (MEM), X-ray absorption spectroscopy (XAS), and first-principles calculations (FPCs). This study reveals that the crystal structures of sintered and annealed (Zr_0.85Y_0.15)­O_2−δ (8YSZ) and (Zr_0.81Sc_0.18Ce_0.01)­O_2−δ (10SSZ) are cubic with the space group <i>Fm</i>3̅<i>m</i> and have large atomic displacement parameters (<i>U</i>_iso). The amounts of tetragonal and other phases are less than 0.2 mol % as estimated by comparison of the observed and simulated X-ray diffraction patterns in the annealed zirconia. For annealed 8YSZ, the <i>U</i>_iso values are reduced, and the electrons around the Zr and oxide ion sites gather at the center of each site. On the other hand, annealed 10SSZ shows the opposite tendency as annealed 8YSZ. From the combined XAS and FPC results, the distortion of the ZrO₈ polyhedra in zirconia is related to the weakening of the two main peaks of the Zr K-edge, while this distortion increases the strength of the Zr pre-edge. The annealing process is found to enhance the periodic and local distortions of the ZrO₈ polyhedra in 10SSZ. In contrast, the annealing process for 8YSZ affects the local distortion of the ZrO₈ polyhedra but does not have an effect on the periodic disorder of the crystal structure, as indicated by <i>U</i>_iso values and MEM analyses. We discuss the correlation among the degradation of oxide ion conductivities by the annealing process and the crystal and local structures of the doped zirconia using experimental and computational methods