Molekulare Mechanismen der Leberfibrogenese als Grundlage für neue Therapiestrategien der chronischen Hepatitis

Chronische Lebererkrankungen, mit dem Endstadium der Leberzirrhose, gehören zu den häufigsten Todesursachen. Im Verlauf der Erkrankung, kommt es zu einer Akkumulation von extrazellulärer Matrix und einem Umbau der Leberarchitektur. Dieser Prozess wird als Fibrose bezeichnet. Bis heute steht keine spezifische Therapie zur Verfügung. Die Behandlung beschränkt sich auf die Ausschaltung der schädigenden Noxe. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer klassischen Arzneimitteltherapie mit dem ß-Blocker Propranolol auf die Fibroseprogression der Primären Sclerosierenden Cholangitis (PSC), einer schwerwiegenden chronische Lebererkrankung, untersucht. Für die Behandlung der PSC wurde das MDR2-/- Mausmodell charakterisiert und verwendet. Um einen Erfolg der Behandlung abschätzen zu können, wurden histochemische und immunhistochemische Färbungen der Lebern angefertigt. Die histologische Begutachtung zeigte eine signifikante Verbesserung der Fibrose (p<0,05) und der Entzündung (p<0,05) in den behandelten Tieren gegenüber den Kontrollen. Die Bestimmung der Transkriptlevel profibrogener und vasokonstriktorischer Mediatoren aus dem Gesamtleberextrakt mittels Real-Time PCR konnte die positiven Ergebnisse der histologischen Begutachtung nicht bestätigen. Deshalb wurden mit Hilfe der Lasermikrodissektion gezielt portale Bereiche der Acinarzone I und Bereiche des Parenchyms (Acinarzone II und III) herausgelasert und zunächst die Transkriptlevel von Procollagen 1A1 als dominantes extrazelluläres Matrixprotein des fibrotischen Prozesses sowie von den profibrogenen Mediatoren, TGF-ß, TNF-a und CTGF untersucht. In den Portalfeldern der behandelten Tiere waren die Transkriptlevel von Procollagen 1A1, TGF-ß, CTGF und TNF-a um über 50% gegenüber den unbehandelten Tieren erniedrigt. Zusätzlich wurden die Expression der profibrogenen und vasokonstriktorischen Mediatoren Angiotensinogen und Endothelin-1 sowie deren Rezeptoren bestimmt. Die deutlichsten Unterschiede konnten bei Endothelin-1 und dem Endothelin-Rezeptor A beobachtet werden. Die Transkriptlevel des Rezeptors waren bei den behandelten Tieren sowohl in den Portalfeldern als im Parenchym um 50% vermindert. Der größte Unterschied war jedoch bei der Betrachtung der Expressionslevel von Endothelin-1 zu verzeichnen, dieser war in den Portalfeldern der behandelten Tiere um 66% erniedrigt. Die Ergebnisse der histologischen Begutachtung sowie der deutliche Rückgang der Transkriptlevel profibrogener Mediatoren in den Portalfeldern von behandelten MDR2-/- Mäusen zeigen den positiven Effekt einer Propranolol-Behandlung auf die Progression einer Leberfibrose im experimentellen PSC Modell. In einem weiteren Ansatz wurde die Rolle von miRNAs während der Fibrogenese untersucht, um diese als mögliche neue therapeutische Ziele zur Behandlung einer Leberfibrose zu identifizieren. Aufgrund der unbekannten Funktion der miRNAs in der Fibrogenese wurde die Expression der leberspezifischen miR-122 in einem experimentellen Gallengangsverschlussmodell (BDO) und einem Hepatitis C Patientenkollektiv untersucht. Auf beiden Kollektiven war eine signifikante Verminderung der miR-122 Expression mit zunehmender Fibrose zu beobachten. Zudem konnte eine hohe negative Korrelation zwischen miR-122 Expression und Hydroxyprolingehalt der Lebern (r=-0,786) bzw. Granulozyteninfiltration r=-0,715) im BDO-Modell festgestellt werden. Da bei vielen chronischen Lebererkrankungen Myofibroblasten den zentralen Zelltyp der Leberfibrogenese darstellen, wurden, um weitere miRNAs in der Fibrogenese zu identifizieren, in vitro Versuche mit primären hepatischen Sternzellen durchgeführt. Mittels Mikroarray-Analyse und Real-Time PCR der RNA-Populationen hepatischer Sternzellen wurde erstmals ein divergentes miRNA-Expressionsprofil nach myofibroblastischer Differenzierung identifiziert. Die stärkste Induktion in Myofibroblasten zeigten die miRNAs miR-125b, miR-22, miR-143, miR-222, miR-221, während miR-126 stark reprimiert vorlag. Bei der Suche möglicher Ziele von miR-125b wurde durch Sequenzvergleich und mit Hilfe eines Reporterassays die Homologie zu lin-4 gezeigt, einer miRNA, die eine entscheidende Rolle in der Larvenentwicklung des Nematoden C.elegans spielt. Ein Ziel von lin-4 in C.elegans ist lin-28. Der Sequenzvergleich der 3’UTR in verschiedenen Spezies und durch Konstruktion eines Reporters, mit einem miR-125b Bindungselement aus der 3’UTR von lin-28, konnte gezeigt werden, dass lin-28 auch in Wirbeltieren ein Ziel von miR-125b darstellt. Die Expression von lin-28 verhielt sich gegenläufig zur hochregulierten miR-125b. Mit der Abnahme von von lin-28 wurden let-7 miRNAs hochreguliert. Damit wurde mit miR-125b eine miRNA gefunden, die eine entscheidende Rolle bei Differenzierungprozessen einnimmt und deren Charakterisierung eine grundlegende Voraussetzung für neue Therapiestrategien geschaffen hat

Hepatocyte Growth Factor (HGF) Inhibits Collagen I and IV Synthesis in Hepatic Stellate Cells by miRNA-29 Induction

BACKGROUND: In chronic liver disease, hepatic stellate cells (HSC) transdifferentiate into myofibroblasts, promoting extracellular matrix (ECM) synthesis and deposition. Stimulation of HSC by transforming growth factor-β (TGF-β) is a crucial event in liver fibrogenesis due to its impact on myofibroblastic transition and ECM induction. In contrast, hepatocyte growth factor (HGF), exerts antifibrotic activities. Recently, miR-29 has been reported to be involved in ECM synthesis. We therefore studied the influence of HGF and TGF-β on the miR-29 collagen axis in HSC. METHODOLOGY: HSC, isolated from rats, were characterized for HGF and Met receptor expression by Real-Time PCR and Western blotting during culture induced myofibroblastic transition. Then, the levels of TGF-β, HGF, collagen-I and -IV mRNA, in addition to miR-29a and miR-29b were determined after HGF and TGF-β stimulation of HSC or after experimental fibrosis induced by bile-duct obstruction in rats. The interaction of miR-29 with 3'-untranslated mRNA regions (UTR) was analyzed by reporter assays. The repressive effect of miR-29 on collagen synthesis was studied in HSC treated with miR-29-mimicks by Real-Time PCR and immunoblotting. PRINCIPAL FINDINGS: The 3'-UTR of the collagen-1 and -4 subtypes were identified to bind miR-29. Hence, miR-29a/b overexpression in HSC resulted in a marked reduction of collagen-I and -IV synthesis. Conversely, a decrease in miR-29 levels is observed during collagen accumulation upon experimental fibrosis, in vivo, and after TGF-β stimulation of HSC, in vitro. Finally, we show that during myofibroblastic transition and TGF-β exposure the HGF-receptor, Met, is upregulated in HSC. Thus, whereas TGF-β stimulation leads to a reduction in miR-29 expression and de-repression of collagen synthesis, stimulation with HGF was definitely associated with highly elevated miR-29 levels and markedly repressed collagen-I and -IV synthesis. CONCLUSIONS: Upregulation of miRNA-29 by HGF and downregulation by TGF-β take part in the anti- or profibrogenic response of HSC, respectively