Derivate nichtsteroidaler Antirheumatika als potentielle Cannabinoid- und Vanilloid-Rezeptor Liganden und Fettsäure-Derivate des Metamizols als dessen pharmakologisch aktives Prinzip

Die vorliegende Dissertationsarbeit beschäftigt sich zum einen mit dem möglichen Eingriff von Metaboliten der nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR), die strukturell mit den Endocannabinoiden bzw. -vanilloiden verwandt sind, in das endogene Cannabinoid- und Vanilloidsystem. Zum anderen wurde der bislang nicht geklärte molekulare Wirkungsmechanismus des Metamizols untersucht und – zumindest teilweise – geklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurden Dopamide, Vanillylamide und 2-Glycerolester von Diclofenac, Ibuprofen, Indometacin, Naproxen und Flurbiprofen synthetisiert. Von den chiralen Wirkstoffen, also Ibuprofen, Naproxen und Flurbiprofen, wurden jeweils beide Enantiomere hergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Dopamide und Vanillylamide von Diclofenac und Indometacin einen Calciumeinstrom in mit hVR1 cDNA transfizierten HEK 293 Zellen auslösen, der durch den TRPV1-Rezeptor vermitteltet wird (EC50 zwischen 0.26 und 1.50 µM). Dies wurde durch Zunahme der Fluoreszenz von mit Fluo 3 AM inkubierten HEK 293 Zellen nachgewiesen. Fluo 3 AM wird intrazellulär zu Fluo 3 hydrolysiert, das mit Ca2+ einen fluoreszierenden Komplex bildet. Die Zugabe von TRPV1-Agonisten bewirkt einen Ca2+-Einstrom, wodurch die Fluoreszenz verstärkt wird. Bei vorheriger Zugabe von Capsazepin, einem TRPV1-Antagonisten, ließ sich keine Zunahme der Fluoreszenz beobachten. Dies beweist, dass der Effekt wirklich durch TRPV1 vermittelt wurde. Da in Ermangelung von Vanillylamin in vivo die Vanillylamide nicht entstehen können, eignen sie sich „nur“ als pharmakologische Tools oder als Vorlage für neue TRPV1-Agonisten. Die Dopamide könnten theoretisch auch in vivo entstehen; bisher ist aber noch nicht nach ihnen gesucht worden. Allerdings waren sowohl die im Rahmen meiner Diplomarbeit (Rogosch, 2003) hergestellten Ethanolamide als auch die Dopamide, Vanillylamide und 2 Glycerolester von jeweils beiden Enantiomeren von Ibuprofen, Naproxen und Flurbiprofen keine Liganden für CB und TRPV1-Rezeptoren. Auch eine Inhibierung der FAAH konnte bei diesen Verbindungen nicht nachgewiesen werden. Dadurch wurde unsere Hypothese, dass NSARs ihre Wirkung zum Teil über diese Metabolite erzielen, die den Endocannabinoiden ähnlich sind, nicht bestätigt. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Aufklärung des Wirkungsmechanismus von Metamizol. Er konnte erstmals teilweise aufgeklärt werden. Metamizol wird im Magen rasch zu N-Methyl-aminophenazon (MAP) hydrolysiert und auch als solches resorbiert. Danach wird es in Aminophenazon (AP) und andere weniger wichtige Metabolite wie N-Acetyl-Aminophenazon (AAP) und N-Formyl-Aminophenazon (FAP) biotransformiert. Die Arachidonsäure-Derivate des N-Methyl-aminophenazons (AA-MAP) und des Aminophenazons (AA-AP) wurden synthetisiert und konnten in vivo im Gehirn und Rückenmark von Mäusen und Ratten nach Fütterungsstudien mit Metamizol nachgewiesen werden. Das Arachidonsäure-Derivat von MAP inhibiert die COX 1 und COX 2 (IC50-Wert im Gewebeextrakt für die PGE2-Bildung 13.2 µM und für die PGI2-Bildung 5.2 µM; IC50 Werte für die PGE2-Bildung 42.2 µM an isolierter COX-1 bzw. 68.9 µM an isolierter COX-2), was durch Inkubation des Gewebeextrakts bzw. isoliertem Enzym mit diesem Metaboliten und anschließender Bestimmung der Prostagladin-Konzentration nachgewiesen wurde. Für CB1- und CB2-Rezeptoren zeigten beide Arachidonsäure-Derivate eine Affinität mit einem Ki-Wert im mikromolaren Bereich (CB1: KiAA MAP = 7.8 µM; KiAA AP = 2.9 µM; CB2: KiAA MAP = 3.0 µM; KiAA AP = 5.4 µM). Dies wurde durch die Radioligandbindungsmethode bewiesen, bei der die Gewebeextrakte jeweils mit einem selektiven radioaktiv markierten Liganden und diesen Metaboliten inkubiert wurden und anschließend die verbliebene Radioaktivität gemessen wurde. Des Weiteren konnte auch die Entstehung dieser Metabolite geklärt werden. Bei FAAH-Knockout-Mäusen, die mit Metamizol gefüttert wurden, ließen sich diese Metabolite nicht oder nur in Spuren nachweisen, während sie bei den Wildtyp-Mäusen in signifikanter Konzentration auftraten. Dies deutet auf eine Schlüsselrolle von FAAH bei der Entstehung dieser Metabolite hin

Isolierung und Pharmakokinetik des Proazulens Matricin aus Matricaria recutita L.

Matricin ist ein lange bekanntes antiphlogistisch wirkendes Proazulen der Kamille. Weil Matricin eine labile Substanz - besonders im sauren Milieu – eine mögliche Vorstufe für den selektiven COX-2-Inhibitor Chamazulencarbonsäure nach oraler Gabe ist, war es Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob Chamazulencarbonsäure nach Gabe von Matricin bioverfügbar ist und eine Rolle bei der Wirkung von Matricin spielt.Erstes wurde erfolgreich gezeigt, zweites als sehr wahrscheinlich nahegelegt. Zuerst wurde Matricin in großen Mengen aus Kamillenblüten extrahiert. Das nach Stahl angewandte Extraktionsverfahren wurde etabliert und die kritischen Schritte der Isolierung optimiert. Die folgende Umkristallisation wurde erleichtert, so dass 2.0 g Matricin in reiner kristalliner Form erhalten wurden. Ein HPLC-Assay zur Chamazulencarbonsäure-Bestimmung im Plasma wurde entwickelt und validiert. Chamazulencarbonsäure wurde aus 100 µl Plasma nach Ansäuern mit 0.01 M H3PO4 mit Diisopropylether extrahiert. Als interner Standard diente Ibuprofen. Die Methode wurde in einem Konzentrationsbereich 0.1-30 µg/ml kalibriert. Zur Validierung der Methode wurde die Präzision und Richtigkeit in der Serie und von Tag zu Tag untersucht. Die Bestimmungsgrenze der Methode lag bei 0.1 µg/ml. 500 mg Matricin und 300 mg Chamazulencarbonsäureoxymethylpivaloylester wurden oral von gesunden Probanden eingenommen und Blutproben abgenommen. Gleichzeitig wurden Prostaglandin, PGE2, PGM und 11-Dehydro-thromboxan B2 im Urin bestimmt. Chamazulencarbonsäure war nach Matricin-Gabe bioverfügbar und erreichte nach 75-90 Minuten ein Konzentrationsmaximum von 1.3-2.2 µg/ml. Verglichen mit Ibuprofen war das Verteilungsvolumen von Chamazulencarbonsäure etwas größer und die Elimination langsamer. Erst 1 h nach oraler Gabe von Chamazulencarbonsäureoxymethylpivaloylester wurde Chamazulencarbonsäure nachgewiesen. Nach 2.5 h wurde das Konzentrationsmaximum von 1.7 µg/ml erreicht. 5 h nach der Einnahme stieg die Konzentration auf 2.4 µg/ml. Die Elimination erfolgte sehr langsam, aber nach 25 h lag die Plasma-Konzentration bei 2.9 µg/ml. Es konnte kein Ester im Blut nachgewiesen werden. Es ist denkbar, dass Chamazulencarbonsäure einem enterohepatischen Kreislauf unterliegt und/oder sich in Fettgewebe einlagert und von dort mobilisiert wird. Die Prostaglandin-Bestimmungen im Harn lassen keine deutliche Aussage über den Einfluss auf die Arachidonsäure-Kaskade zu. Die renale Exkretionsrate von PGE M ist nur nach Matricin-Gabe um 40% gesunken, was auf eine systemische Prostaglandin-Synthese-Inhibition hinweist. Ein Einfluss auf die Prostaglandin-Synthese nach der Gabe des Oxymethylpivaloylesters der Chamazulencarbonsäure wurde aber nicht nachgewiesen. Die aus Stevia serrata Cav. extrahierte Chamazulencarbonsäure wurde mittels NMR auf Enantiomerenreinheit untersucht. Sie ist im Gegensatz zu Chamazulencarbonsäure aus Matricaria und Achillea R-konfiguriert. Neue azulen Verbindungen wurden synthetisiert. Insbesondere gelang die Synthese des in Kamille vorkommenden Azulenaldehyds Chamaviolin in einem Schritt aus Chamazulen

Speziesspezifische proteomische Aspekte der axonalen Regeneration retinaler Ganglienzellen am Beispiel der Ratte (Rattus norvegicus) und des Affen (Callithrix jacchus)

Die axonale Regeneration im Zentralen Nervensystem (ZNS) ist ein äußerst komplexer Vorgang, der unter natürlichen Bedingungen nicht stattfindet, gleichwohl jedoch prinzipiell möglich ist. So unterliegen axotomierte RGZ der adulten Ratte einem progressiven Degenerationsprozeß, können jedoch nach entsprechender Vorbehandlung und experimentellen Bedingungen partiell regenerieren. Ziel der Regenerationsforschung ist es daher, durch gezielte Modulation bzw. Applikation von Wirkstoffen das Fortschreiten des Zelltodes aufzuhalten und die Neurone zur axonalen Regeneration zu stimulieren. Im Rahmen dieser Dissertation sollten regenerationsassoziierte Proteinexpressionsveränderungen untersucht werden, um ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen zu erlangen und neue Ansatzpunkte zur gezielten Stimulation der Regeneration zu finden. Dazu wurden zunächst Untersuchungen am etablierten Regenerationsmodell der Rattenretina vorgenommen, bei der eine parallel zur konditionierenden Quetschung des ON gesetzte Linsenverletzung zur verstärkten Regeneration führt. Durch morphologische, biochemische und immunhistochemische Analysen konnte gezeigt werden, dass die regenerationsstimulierende Wirkung der Linsenverletzung über andere Signalkaskaden vermittelt wird, als die nach Quetschung. Neben der von anderen Gruppen postulierten Aktivierung von Makrophagen, konnten hier der neurotrophe Faktor bFGF und die alpha-, beta-, und gamma-Kristalline als mögliche Vermittler dieser Effekte bestimmt werden. Neben diesem vorbehandlungsabhängigen Modell der Rattenretina wurde ein spontan regenerierendes System in Form der Affenretina gefunden, etabliert und charakterisiert. Dieses zeigte eine im Vergleich zur Rattenretina höhere Substratspezifität und erlaubte die Untersuchung altersspezifischer Regenerationsvorgänge. Biochemische und immunhistochemische Untersuchungen offenbarten speziesübergreifende Proteomveränderungen infolge axonaler Regenerationsprozesse. So konnten in beiden Modellen die verstärkte Expression eines GAP-43-ähnlichen Proteins in regenerierten Zuständen nachgewiesen werden. Die parallele verstärkte Expression von GFAP demonstrierte eine speziesübergreifende, entscheidende Rolle der Glia für das Regenerationsgeschehen und stand nicht im Widerspruch zu einer erfolgreichen Regeneration. Darüberhinaus zeigten Kristalline in beiden Modellen eine Veränderung ihrer Expression und Lokalisation im Zuge der Regeneration, die ihre fundamentale Bedeutung für diese Prozesse nahelegen. Zur erweiterten Beobachtung der differentiellen Proteinexpression wurde die Technik der 2D-PAGE etabliert und die hochaufgelöste Darstellung des Retinaproteoms optimiert. In Kombination mit MALDI-MS wurde eine Kartierung des Retinaproteoms der Ratte und des Affen vorgenommen. Es wurden 32 (Rattenretina) bzw. 23 Proteine (Affenretina) unterschiedlicher Funktion und Lokalisation identifiziert und Proteomkarten der Retinae beider Spezies als Basis für weitere, nachfolgende Untersuchungen unter variablen Aspekten generiert. Die proteomische Analyse regenerierter und nicht-regenerierter Retinae offenbarte die differentielle Regulation verschiedener Proteine. Bei dem Modell der Rattenretina konnten zwei unter nicht-regenerativen Bedingungen verstärkt exprimierte Proteine als Synaptotagmin I und High mobility group protein-1 (HMG-1) identifiziert werden. Komparative Analysen der 2D-Gele des Affen offenbarten die alters- und regenerationsabhängige Expression mehrerer Proteine, die als Calmodulin, alpha A-Kristallin, Fatty-acid binding protein (FABP) und Cellular retinoic acid bindig protein (CRABP) bestimmt wurden. Aufgrund der bislang bekannten Funktionen dieser Proteine stellen sie interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen dar. Diese Arbeit konnte damit zahlreiche in das Regenerationsgeschehen involvierte Faktoren und daran gekoppelte Signalwege offendecken. Durch die weitere funktionelle Untersuchung dieser Kandidaten, insbesondere der Kristalline, muß ihre Bedeutung für die Regeneration geklärt werden. Die generierten Karten der Retinaproteome von Ratte und Affe stellen die Basis für weitere differentielle Analysen unter variablen Aspekten dar. Durch die Etablierung des neuen Regenerationsmodells der Affenretina und der 2D-PAGE bestehen nun ausgezeichnete Möglichkeiten ein besseres Verständnis regenerationsassoziierter Prozesse und weitere Ansatzpunkte zu ihrer Stimulation zu finden

FAIR Convergence Matrix: Optimizing the Reuse of Existing FAIR-Related Resources

The FAIR principles articulate the behaviors expected from digital artifacts that are Findable, Accessible, Interoperable and Reusable by machines and by people. Although by now widely accepted, the FAIR Principles by design do not explicitly consider actual implementation choices enabling FAIR behaviors. As different communities have their own, often well-established implementation preferences and priorities for data reuse, coordinating a broadly accepted, widely used FAIR implementation approach remains a global challenge. In an effort to accelerate broad community convergence on FAIR implementation options, the GO FAIR community has launched the development of the FAIR Convergence Matrix. The Matrix is a platform that compiles for any community of practice, an inventory of their self-declared FAIR implementation choices and challenges. The Convergence Matrix is itself a FAIR resource, openly available, and encourages voluntary participation by any self-identified community of practice (not only the GO FAIR Implementation Networks). Based on patterns of use and reuse of existing resources, the Convergence Matrix supports the transparent derivation of strategies that optimally coordinate convergence on standards and technologies in the emerging Internet of FAIR Data and Services

Synthesis, structural characterization and antimycobacterial evaluation of several halogenated non-nitro benzothiazinones

8-Nitro-1,3-benzothiazin-4-ones (BTZs), with BTZ043 and PBTZ169 as the most advanced compounds, represent a new class of potent antitubercular agents, which irreversibly inhibit decaprenylphosphoryl-β-D-ribose-2′-epimerase (DprE1), an enzyme crucial for cell wall synthesis in the pathogen Mycobacterium tuberculosis. Synthesis, structural characterization and in vitro testing against Mycobacterium aurum DSM 43999 and M. tuberculosis H37Rv of halogenated 2-(4-ethoxycarbonylpiperazin-1-yl)-1,3-benzothiazin-4-ones lacking a nitro group are reported. X-ray crystallography reveals that the structure of the BTZ scaffold can significantly deviate from planarity. In contrast to recent reports, the results of the present study indicate that further investigation of halogenated non-nitro BTZs for antitubercular activity is less than a promising approach.The TWAS-DFG Coorperation Visits Programme from the Deutsche Forschungsgemeinschaft and The World Academy of Sciences. Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.http://link.springer.com/journal/44am2022Paraclinical Science

Novel insight into the reaction of nitro, nitroso and hydroxylamino benzothiazinones and of benzoxacinones with Mycobacterium tuberculosis DprE1

Abstract Nitro-substituted 1,3-benzothiazinones (nitro-BTZs) are mechanism-based covalent inhibitors of Mycobacterium tuberculosis decaprenylphosphoryl-β-D-ribose-2′-oxidase (DprE1) with strong antimycobacterial properties. We prepared a number of oxidized and reduced forms of nitro-BTZs to probe the mechanism of inactivation of the enzyme and to identify opportunities for further chemistry. The kinetics of inactivation of DprE1 was examined using an enzymatic assay that monitored reaction progress up to 100 min, permitting compound ranking according to k inact/K i values. The side-chain at the 2-position and heteroatom identity at the 1-position of the BTZs were found to be important for inhibitory activity. We obtained crystal structures with several compounds covalently bound. The data suggest that steps upstream from the covalent end-points are likely the key determinants of potency and reactivity. The results of protein mass spectrometry using a 7-chloro-nitro-BTZ suggest that nucleophilic reactions at the 7-position do not operate and support a previously proposed mechanism in which BTZ activation by a reduced flavin intermediate is required. Unexpectedly, a hydroxylamino-BTZ showed time-dependent inhibition and mass spectrometry corroborated that this hydroxylamino-BTZ is a mechanism-based suicide inhibitor of DprE1. With this BTZ derivative, we propose a new covalent mechanism of inhibition of DprE1 that takes advantage of the oxidation cycle of the enzyme

Crystal structure and antimycobacterial evaluation of 2-(cyclohexylmethyl)-7-nitro-5-(trifluoromethyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-one

The title compound, C15H15F3N2O3S, crystallizes in the monoclinic system, space group I2/a, with Z = 8. As expected, the nine-membered heterobicyclic system is virtually planar and the cyclohexyl group adopts a chair conformation. There is structural evidence for intramolecular N—S...O chalcogen bonding between the benzisothiazolinone S atom and one O atom of the nitro group, approximately aligned along the extension of the covalent N—S bond [N—S...O = 162.7 (1)°]. In the crystal, the molecules form centrosymmetric dimers through C—H...O weak hydrogen bonding between a C—H group of the electron-deficient benzene ring and the benzothiazolinone carbonyl O atom with an R22(10) motif. In contrast to the previously described N-acyl 7-nitro-5-(trifluoromethyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-ones, the title N-cyclohexylmethyl analogue does not inhibit growth of Mycobacterium aurum and Mycobacterium smegmatis in vitro