Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek (MEKC, CZE) fejlesztése. Gyakorlati alkalmazások biológiailag aktív molekulák fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságainak jellemzésére = Development of high performance separation techniques (MEKC, CZE). Practical applications for physico-chemical and biological characterisation of biologically active molecules

Az elválasztási módszerek fejlesztése során vizsgáltuk a CZE-ben puffer módosítóként alkalmazott szerves oldószereknek az elválasztási mechanizmusra, az analizált molekula konformációjára/szolvatációjára gyakorolt hatását. Megkezdtük a biokompatiblis CZE módszerek kifejlesztése során alkalmazható polimer bevonatok tulajdonságainak, alkalmazhatóságának vizsgálatát.Bizonyítottuk, hogy a MEKC-ben bevezetett relatív micelláris fázistartózkodási idő alkalmas egyrészt az analizált molekulák lipofilitásának kísérleti meghatározására, másrészt alkalmas a MEKC-ben alkalmazandó micelláris fázisok lipofilitásának számszerű jellemzésére. Bevezettük a CLOGP50 fogalmát, amely az a lipofilitási érték, amellyel rendelkező molekula teljes analízis idejének éppen a felét tölti a micelláris fázisban. Bizonyítottuk, hogy ez a CLOGP50 érték alkalmas a micelláris fázisok egymással való összehasonlítására. Ez támpontot adhat a MEKC módszerfejlesztés során az adott elválasztási feladathoz leginkább megfelelő megosztófázis kiválasztására.CZE és HPLC módszereket dolgoztunk ki a vizsgált molekulák fizikai-kémiai paramétereinek meghatározására. Bizonyítottuk a kísérleti lipofilitási adatok és a molekulák biológiai aktivitása közötti jó összefüggést. Ezeket a módszereket különböző kémiai szerkezetű molekulakönyvtárak jellemzésében, lipofilitásuk meghatározásában, valamint a szintetikus tervezőmunka támogatásában az optimalizálni érdemes szerkezetek kiválasztásában használtuk fel. | Effect of the organic solvents applied as buffer modifiers in capillary zone electrophoresis (CZE) on the separation has been investigated. Development and characterization of biocompatible polymers applicable as coating material in capillary electrophoresis has been started. Application of the normalized micellar phase residence time has been suggested in micellar electrokinetic chromatography (MEKC), its applicability for the characterization of the lipohilicity of the analytes were proved. CLOGP50 value was defined and it has been applied to compare the lipophility of the pseudo-stationary phases applied in MEKC. CZE and HPLC methods has been developed and applied to determine physico-chemical parameters of molecules possessing antiproliferative activity. Good correlation between the experimentally determined physico-chemical parameters of the investigated molecules and the biological activity of the same molecules has been proved. These separation methods developed in our laboratory has been applied in characterization of molecular libraries of different chemical nature, and were applied to support the optimization of the chemical structure of the core molecules

Nagyfelbontású elválasztástechnikai módszerek (MEKC, CZE, HPLC) alkalmazása bioaktív molekulák jellemzésében. = Application of high-performance separation methods (MEKC, CZE, HPLC) to characterize bioactive molecules.

Molekulakönyvtárak vizsgálatára kidolgozott HPLC módszerrel összefüggéseket állapítottunk meg a szerkezet-hidrofóbitás és szerkezet-membránkölcsönhatás jellemzésére. Mért és számított lipofilitási adatok valamint biológiai aktivitás alapján egy lipofilitási tartományt határoztunk meg ahol jó antiproliferatív hatás várható. Membránokkal való kölcsönhatást immobilizált mesterséges membrán (IAM) oszlopon vizsgáltuk. Izomer vegyületeknél a tradicionális fordított fázisú oszlopnál, az IAM oszlop hatékonyabb volt a vegyületek elválasztásában, így lipofilitásuk megkülönböztetésében is. Fizikai határfelületi vizsgálati módszerekkel különböző polimerek bevonatképző tulajdonságait, a lipid réteg és hatóanyagok kölcsönhatását határoztuk meg. A falbevonat PLA/Pluronic összetételének változtatásával a nem kívánatos adszorpció csökkenthető. A micelláris elektrokinetikus kromatográfiában alkalmazott detergensekből, kevert pszeudo-állófázisok lipofilicitását és metilén-szelektivitását vizsgálva a retenciós paraméterek és a kevert pszeudo-állófázisok összetétele között lineáris összefüggést állapítottunk meg. Klinika II fázison túljutott, antitumor és neurogén gyulladásgátló hatású, TT232 heptapeptid követő molekuláinak a színtézise és karakterizálása során új, hatékony, szerkezetileg egyszerűbb, szabadalommal védett, orálisan is ható molekulákhoz jutottunk el, lehetőséget nyújtva ezzel a TT232 követő molekuláiként egy új gyógyszer kifejlesztésére. | By the aid of efficient and fast HPLC methods structure-lipophilicity and structure-membrane interactions of molecular libraries were characterized. On the bases of measured and calculated lipophilicity data and biological activity an optimal lipophilicity range was determined for good antiproliferative activity. Membrane interactions were measured on immobilized artificial membrane (IAM) column. The separation of isomeric compounds was more effective on IAM columns than on traditional RP column, thus in differentiating in their lipophilicity. Different methods were used to study the interaction of different polymers at air/solution interface and to investigate the molecular interaction between the surface layer and the compound dissolved in the subphase. The unwanted adsorption can be reduced by changing the coating PLA/Pluronic ratio. Lipophilicity and methylene selectivity of mixed pseudo-stationary phases applied in micellar electrokinetic chromatography was investigated. Good linear correlation was obtained between the measured retention parameters and the composition of the mixed phases. In the course of the synthesis and characterization of the follow-up molecules of TT232, a heptapeptide inhibiting cell proliferation and neurogenic inflammation with a completed Phase II Cinical trial, new, effective, simplified, patented and orally active molecules were identified, giving possibility for the drug development of new follow-up molecules of TT232

SSTR4 illetve capsaicin receptor mediált neurogéngyulladás gátló gyógyszerhatóanyagok optimalizációja, karakterizációja és farmakofor model generálása = Optimization, characterization and pharmacophore modeling of SSTR4 or capsaicin receptor mediated neurogenic inflammation inhibiting drug candidates

A Klinika II fázisban lévő SSTR4 receptoron ható TT-232 heptapeptid olyan új, eltérő szerkezetű származékait állítottuk elő, ahol a biológiai hatás szempontjából fontos aminosavakat egyrészt egy pirazinon gyűrűvel ciklizáltuk, másrészt egy flexibilis magra építettünk fel szimmetrikusan három aminosavat, végül dipeptidamidokig egyszerűsítettük a szerkezetet. Az új követő-molekulákra erős sejtproliferáció- és hatékony neurogén gyulladás-gátlás a jellemző orális adagolás mellett is. A TT-232 védett N-terminális tripeptidje egerekben, az angiogenezis indukálás vizsgálatára szolgáló 'matrigél modellben' tízszer annyi vérér képződését eredményezte, mint a kontroll állatokban. A vegyületek és biológiai hatásuk védelmére szabadalmi bejelentéseket tettünk. A TT-232 molekula bizonyos szerkezeti elemeit felhasználva célzott molekulakönyvtárakat állítottunk elő, amelyekben a neurogén gyulladást gátló, de a kiindulási molekulánál kedvezőbb ADME paraméterekkel rendelkező tagokat találtunk. HPLC módszert dolgoztunk ki, amelyben a mért és számított lipofilitási adatok alapján meghatározhatjuk azt a lipofilitási tartományt (egy adott könyvtár körében) ahol nagy valószínűséggel jó antiproliferatív hatást mutató molekulák találhatók. A szomatosztatin és capsaicin receptor mediálásában fontos szerepet játzószó kináz molekulák tesztelésére beállítottuk az IMAP fluoreszcens mérési módszert, és az ezáltal kiválasztott hitmolekulákat karakterizáltuk szabadalmaztatási eljáráshoz. | Novel structurally different follow-up molecules of the heptapeptide acting on SSTR4 receptor TT-232, presently in Clinical phase II trial, have been synthesized. The biologically important amino acids were cyclized by a pyrazinon ring or the three amino acids were coupled symmetrically to a flexible core. The structure of the parent peptide was finally simplified into dipepitde amides. The new molecules effectively inhibit tumorous cell proliferation and neurogenic inflammation even during oral administration. The protected N-terminus tripeptide of TT-232 proved to be a strong angiogenesis promoting material in the so called matrigel test. The number of the newly formed vessels in the matrigel was ten times as much as in the control animals. New focused molecular libraries were generated using certain elements of the TT-232 molecule. Chemical and biological evaluation of the libraries resulted in active molecules with improved ADME parameters. An effective HPLC method has been developed for the determination of the lipophylicity range for good antiproliferative activity based on measured and calculated lipofilicity parameters of a given library. For screening kinase enzymes mediating the effect of somatostatin and capsaicin receptors a fluorescence assay (IMAP) has been developed and the selected hit molecules have been characterized for patenting

Tuneable surface modification of PLGA nanoparticles carrying new antitubercular drug candidate

Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA 50:50) nanoparticles (NPs) were prepared and characterized in terms of size, composition, zeta potential and colloidal stability. Surface modification of PLGA NPs where primary amino groups were introduced to the Pluronic surface layer was developed. This method allows modulation of the charge character of the nanoparticle surface and provides functional groups for chemical reactions useful for targeting while retaining the aggregation stability of the system. The nanoparticles showed significant interaction with model membrane system (DPPC and DPPC+DPPG lipid layers) depending on the amount and type of Pluronic applied for stabilization of NPs. A new antitubercular drug candidate was encapsulated into the PLGA NPs. The cellular uptake and the intracellular efficacy against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) of the drug and the drug loaded nanoparticulate systems were investigated. These formulations were successfully taken up by MonoMac6 human monocyte cells and highly enhanced the availability and efficacy of the drug against Mtb which was demonstrated in comparative in vitro experiments

Novel lipoamino acid & liposaccharide based system for peptide delivery: application for administering tumour selective somatostatin analogues

Lipoamino acid and liposaccharide conjugates of somatostatin analogue TT-232 were synthesized to modify the physicochemical properties of the parent peptide. The relative position, the number, and the nature of the lipid and/or saccharide moieties were varied. Experiments in vitro clearly showed that many compounds modified at the N- and/or C-terminus with lipid or sugar moieties retained the biological activity of the parent compound. An interesting construct was synthesized containing lipid and sugar units at opposite ends of the somatostatin analogue, so that the entire molecule could be considered as an amphipathic surfactant