Reliable handling of highly A/T-rich genomic DNA for efficient generation of knockin strains of Dictyostelium discoideum

Background: Social amoeba, Dictyostelium discoideum, is a well-established model organism for studying cellular physiology and developmental pattern formation. Its haploid genome facilitates functional analysis of genes by a single round of mutagenesis including targeted disruption. Although the efficient generation of knockout strains based on an intrinsically high homologous recombination rate has been demonstrated, successful reports for knockin strains have been limited. As social amoeba has an exceptionally high adenine and thymine (A/T)-content, conventional plasmid-based vector construction has been constrained due to deleterious deletion in E. coli. Results: We describe here a simple and efficient strategy to construct GFP-knockin cassettes by using a linear DNA cloning vector derived from N15 bacteriophage. This allows reliable handling of DNA fragments whose A/T-content may be as high as 85 %, and which cannot be cloned into a circular plasmid. By optimizing the length of recombination arms, we successfully generate GFP-knockin strains for five genes involved in cAMP signalling, including a triple-colour knockin strain. Conclusions: This robust strategy would be useful in handling DNA fragments with biased A/T-contents such as the genome of lower organisms and the promoter/terminator regions of higher organisms

The foreign children's complex "PERMON": situation of the children and adequacy of services

Práce je zaměřena na problematiku nezletilých cizinců bez doprovodu na území ČR. Nezletilým cizincem bez doprovodu se rozumí osoba mladší 18 let, která se nachází na území našeho státu bez doprovodu rodičů případně jiných zákonných zástupců a nebo se jejich zákonní zástupci o ní nemohou či nechtějí postarat. Nejčastější příčiny, pro které děti opouštějí svou zemi, patří nedostatek ochrany ze strany státu, rozpad rodiny, strach vyvolaný válečným konfliktem nebo chudoba. Tyto děti jsou v ČR umisťovány do Zařízení pro děti-cizince. Jedná se o státní příspěvkovou organizaci Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy. Její součástí je diagnostický ústav, dětský domov se školou, výchovný ústav, speciální základní škola a praktická škola. Ústřední otázkou, kterou se práce zabývá je, zda část zařízení sídlící v areálu Permon uspokojivě naplňuje potřeby svých klientů. V práci je věnován prostor popisu legislativního kontextu dané oblasti, situace nezletilého bez doprovodu po příchodu na území ČR, některým principům zacházení s dětmi-cizinci a postupům vhodným při jednání s touto skupinou dětí. Dále je blíže charakterizováno Zařízení pro děti-cizince se zaměřením na areál Permon. Teoretická část se zabývá i základními potřebami dětí, potřebami nezletilých bez doprovodu a specifice jejich situace. Cílem práce je..