Individuális stresszválasz heterogén sejtpopulációban = Individual stress response in heterogeneous cell population

A hősokkválasz a természetben található egyik legősibb, evolúció során megőrzött védelmi mechanizmus. A sejtek környezeti változásokra adott válaszának ill. alkalmazkodóképességének megértése érdekében a stresszválasz tanulmányozása rendkívüli jelentőséggel bír, különösen patofiziológiás körülmények között. Jelen projekt keretében emlős sejtek genetikailag homogén populációi egy sejt szintű stressz válaszát tanulmányoztuk a legmodernebb ultraszenzitív képalkotó technikák alkalmazásával. A létrehozott egyedi fluoreszcenciás képalkotó rendszer és a kidolgozott sokoldalú sejtanalitikai eszköztár segítségével lehetővé vált egy nagy információ tartalmú fenotípus profil meghatározása a génexpresszió és a biokémiai jelátviteli utak ill. szerkezeti változások sejtszintű követésével. Összefüggést találtunk a sejtek hősokkra adott válaszának erőssége/érzékenysége és a membrán domének szerkezete ill. összetétele között. Kutatásaink során bizonyítást nyert, hogy a plazmamembrán koleszterin szintje meghatározó a stressz érzékelésében valamint a válasz erősségében. Kimutattuk, hogy a sejtciklus részben felelős a megfigyelt heterogenitásért, de más faktorok is hozzájárulnak a jelenséghez. A patofiziológiás körülmények között kulcsszereppel bíró hősokkfehérjék szelektív modulációjáért felelős specifikus membrán domének azonosítása közelebb vezethet bennünket annak megértéséhez, hogy miért döntheti el akár néhány sejt egy teljes populáció sorsát és ezzel egy adott betegség kimenetelét. | The heat shock response is one of the most ancient and evolutionarily conserved protective mechanisms found in nature. The study of the cellular stress response is of great importance to our understanding of how cells respond and adapt to various changes in their environments especially during different pathophysiological conditions. In the present project we aimed to characterize the individual variability in the stress response of genetically homogeneous mammalian cell population by state of the art ultrasensitive high content imaging. We set up a unique fluorescence imaging system and established robust cellular analysis tools to perform high-content phenotype profiling, linking gene expression to biochemical signaling pathways and structural changes in the cell. We found correlation between structure and composition of membrane domains and the ability and/or sensitivity of cells to respond to heat shock. We identified the level of plasma membrane cholesterol as a key constituent of the stress perception and/or early signaling. We showed that cell cycle, at least partially, is responsible for the observed heterogeneity but other factors should also be taken into account. We identified specific changes in membrane domain structure leading to selective refinement of heat shock proteins in a heterogeneous cell population which could help us to understand why a small subpopulation of cells could determine the outcome of important disease states

A fogbél válaszreakcióinak, kompenzáló mechanizmusainak vizsgálata patkányfogak pulpális erein vitálmikroszkópos modellen = Examination of pulps reaction and compensatory mechanism on rat dental pulp vessels on vitalmicroscopic model

A patkánymetszőfog-pulpa vitálmikroszkópos modellje optimális az inicialis toxicitás okozta pulpális változások kimutatására. Kísérleteinkben a self-etch adhezívek hatására bekövetkező akut változásokat vizsgáltuk. A fogászati bondanyagok/adhezívek lokális applikációja reverzibilis és irreverzibilis változásokat okozhat. Az erősen savas (pH 0,8) adhezív veszélyeztette a pulpális mikrocirkulációt, míg a közepesen erős savhatású önsavazó bondrendszer (pH 1,5) csak reverzibilis dilatációt okozott. A NO-szintáz blokkolók (L-NAME) lokalis hatását eddig nem vizsgálták. Vizsgálatainkban nyugalmi feltételek mellett, illetve bondanyag applikációját követően közvetlenül tanulmányoztuk hatását patkányfogak pulpális arterioláinak belső átmérőjére. Az L-NAME redukálta a pulpális arteriolák érátmérőjét mind nyugalmi, mind bondanyag okozta hyperaemia esetén. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a nitorgénmonoxidnak meghatározó szerepe szerepe lehet mind a bondanyagok okozta akut vasodilatatióban, mind a basalis arteriális tónus fenntartásában. | The vitalmicroscopic model of the rat first incisor's pulp is an optimal technique for demonstrating the initial toxicity caused pulpal changes. In our study we investigated the acut effect of self-etch adhesives. The local application of dental bondmaterials/adhesives could cause reversible and irrevesible changes. The strong acidic adhesive (pH 0,8) compromised the pulpal microcirculation, while the 'intermedier strong' (pH 1,5) caused reversible dilatation. The blockers of NO synthase had never been investigated before. In our experiment we studied the effect of NOS inhibitor on basal condition and after bond material application using vitalmicroscopic method. L-NAME reduced the diameter of the pulpal arteriole both in basal and after bond material-induced hyperaemic conditions. Our data suggest that the local formation of NO may have a significant role in the acute vasodilatation induced by bond material application and also in maintenance of basal pulpal arteriolar tone

A stresszfehérjék és lipidek membrán kapcsolt homeosztázisa = Coupled homeostasis of membrane lipids and stress proteins

1. Megállapítottuk, hogy az IbpA/B fehérje in vivo különböző mértékben asszociálódik az E. coli membrán(ok)hoz. Langmuir-Blodget monolayer kísérletekben igazoltuk az IbpAB membránlipid kötését. Jellemeztük az E. coli IbpAB- mutánst mind molekuláris, mind fiziológiás szinten. Megállapítottuk, hogy az IbpAB- mutáns törzsek rendelkeznek „membrán-fenotípussal”, a vad típustól markánsan eltérő lipid zsírsavösszetétellel, valamint megváltozott fluiditással és permeabilitással. A lipidomikai kísérletek rávilágítottak a fluiditásváltozás kompenzációs jellegére, a homeosztatikus membrán adaptáció elvének megfelelően. A membránlipidek és hősokkfehérjék kapcsolatának egy másik dimenziójára kívántunk rávilágítani a vad típusú és mutáns törzsek globális „transcriptome” analízisével. A wt és az IbpAB mutánsok mRNS profilja hatalmas eltérést mutat, a változások gének egész sorát érintik, amelyek megértése további kísérleteket kíván. 2. Munkánk során elsőként igazoltuk Synechocystisben a DnaK2 fehérje szubfrakciójának tilakoid asszociációját. A DnaK2 részleges hiánya megváltoztatta a tilakoid membrán lipid- és zsírsavösszetételét, valamint a membrán fizikai állapotát. A membránváltozások befolyásolják a tilakoid membrán működését, ami eltérő hő- illetve UV-B stresszérzékenységben is megnyilvánul. A DnaK2 protein részleges hiánya UV károsodás után a PSII “repair” részleges inhibícióját eredményezte. Ily módon kimutattuk egy új, membránasszociált DnaK-függő stresszvédő mechanizmus létezését. | 1. In E. Coli the small heat shock protein IbpAB interacts with membranes in vivo and in vitro and rigidifides it which counterbalances heat-induced fluidization, indicating a protective role of this Hsp in the heat-shocked membrane. IbpAB- cells have an increased membrane permeability but higher outer membrane transition temperature and better survival at heat challenge. The improved survival is linked to the altered membrane phenotype. These include unique fatty acid changes and fluidization in the hydrophobic core of the membranes, which are associated with better survival upon heat challenge. 2. We have shown that in Synechocystis PCC6803 DnaK2 chaperon interacts with the thylakoid membrane, especially with the phosphatidyl glycerol (PG) lipid of the thylakoid. In DnaK2- cells the fatty acid composition of the thylakoid membrane differed from that of the wild type resulting in altered physico-chemical properties. We exposed cells to UV-B damage and concluded, that lack of the DnaK2 leads to partial inhibition of PSII repair and the rate of forward electron transport between QA and QB quinone electron acceptors is slowed down. PG plays an important role in binding extrinsic proteins required for a functional Mn cluster on the donor side of PSII. The binding of DnaK2 may take place trough binding specifically to PG and/or with the PSII complex. This interaction leads directly or indirectly to change in membrane fluidity which influences PSII electron transport

Stresszválasz: membrántól membránig = Stress response: from membrane to membrane

A 2005-ben befejezett munka során széles kisérleti háttere, különböző sejtes modellekre alapozva szisztematikus munkával igazoltuk az un "membrán szenzor" hipotézis univerzális érvényességét. A stresszfehérje (molekuláris chaperon) válasz sejt- és molekuláris hátterének egy teljesen új aspektusát tártuk fel, amikor is a stresszválasz primér jelképző funkcióját nem a proteotoxicitás, hanem a membránok lipidfázisa által kontrolált állapotváltozások látják el. A membránok lipid-lipid ill. lipid-fehérje kölcsönhatásaiban ("molekuláris kapcsolók") stressz (pld. magashőmérséklet) által kiváltott változásokat a membránok fehérje és lipidösszetételének ill. mikrodomén szintű finomszerveződésének szintjén követtük. Igazoltuk a stresszfehérjék lipidmediálta kölcsönhatásait. Kutatásaink újgenerációs gyógyszerek (pld. hidroximsavszármazékok) kifejlesztését alapozták meg. Ezek a stresszfehérje szintézis megfelelő kontrolljával olyan patológiás állapotok gyógyítását teszik lehetővé, mint a 2. típusú diabétesz, vagy a neurodegeneratív betegségek. | Based on broad experimental approaches and different cellular models in the course of the realization of this OTKA project we provided evidences on the universal validity of the ?membrane sensor? hypothesis. We explored a novel aspect of stress protein response by highlighting those conditions (mild heat stress, membrane defects in disease states, aging, etc.) under which the primary cellular stress sensing mechanism operates by subtle, lipid-phase controlled membrane alterations, rather than by massive proteotoxicity (severe stress). Membrane changes induced by various stress conditions (likely governed by lipid-lipid and lipid-protein interactions) were systematically monitored by real-time single molecule microscopy and coupled to the downstream signaling pathways, leading ultimately to hsp transcription. We have shown, that stress proteins are capable to transport and translocate to the lipid phase of membranes. Our investigations opened the door for the development of a new-generation of drugs. There mode of action is linked to the normalization of dysregulated stress protein response in disease states, like type2 diabetes or neurodegenerative diseases

Könyvszemle

Grüll Tibor: A tenger gyümölcsei. A tengerek szerepe a Római Birodalom gazdaságában. Pécs, Kronosz Kiadó, 2016. Juhász Erika: A Húsvéti krónika. Prolegomena. (Apollo Könyvtár 35.) Budapest, Argumentum Kiadó, 2014. Zsuzsanna Ötvös: “Janus Pannonius’s Vocabularium”. The Complex Analysis of the Ms. ÖNB Suppl. Gr. 45. (Antiquitas – Byzantium – Renascentia XIV.) Budapest, ELTE Eötvös József Collegium, 2015. Corollarium. A Szegedi Tudományegyetem Klasszika-Filológiai és Neolatin Tanszékének online folyóirata: http://www2.arts.u-szeged.hu/cla/Corollarium/index.htm; ISSN 2064-5023; 1–2. évfolyam (2013–2014)

Rac1 Participates in Thermally Induced Alterations of the Cytoskeleton, Cell Morphology and Lipid Rafts, and Regulates the Expression of Heat Shock Proteins in B16F10 Melanoma Cells

Eukaryotic cells exhibit a characteristic response to hyperthermic treatments involving morphological and cytoskeletetal alterations and induction of heat shock protein synthesis. Small GTPases of the Ras superfamily are known to serve as molecular switches which mediate responses to extracellular stimuli. Here we addressed how small GTPase Rac1 integrates signals from heat stress and induces simultaneously various cellular changes in mammalian cells. Evidencing that Rac1 is implicated in the heat shock response, first we showed that both mild (41.5 °C) and severe (43 °C) heat shock induced membrane translocation of Rac1. Upon the inhibition of the activation (NSC23766) or palmitoylation (2-bromopalmitate) of Rac1, the size of its plasmamembrane bound pool was significantly decreased. Heat shock induced alterations in the cytoskeleton and cell morphology were prevented using the above inhibitors. Earlier we hypothesized that the level and size distribution pattern of Chol-rich rafts are directly coupled to the triggering mechanism of stress sensing and signaling. As a striking finding, when plasma membrane localization of Rac1 was inhibited we obtained reduced raft domain size at 43 °C. The above documented effects of Rac1 inhibitors were accompanied with a strongly decreased expression of hsp25 and hsp70 under both mild and severe heat stress conditions