The TetR-inducing aptamer 12-1: An RNA as transcriptional activator

Aptamere sind kurze RNA-Moleküle, die über in vitro Selektion aus großen kombinatorischen Bibliotheken selektiert werden und einen Liganden mit hoher Affinität und Spezifität binden. In den letzten 20 Jahren hat ihre Bedeutung als Werkzeug für die Genregulation, zur Analyse von Molekülinteraktionen und in der Diagnostik als Alternative zu Antikörpern stetig zugenommen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein bakterieller Repressor durch eine kleine endogen exprimierte RNA in seiner Funktion beeinflusst werden kann. Das Zielmolekül war der Tetrazyklinrepressor (TetR), der als Dimer an seine spezifische Operatorsequenz (tetO) auf der DNA bindet, wodurch die Transkription von Tetrazyklinresistenzgenen reprimiert wird. In vorangegangenen Experimenten wurde über in vitro Selektion ein TetR bindendes RNA Aptamer identifiziert. Die Ausgangs-Bibliothek bestand aus einer 50 Nukleotid-langen randomisierten Sequenz mit flankierenden konstanten Bereichen. Durch 12 Zyklen von in vitro Transkription, Selektion und reverser Transkription wurden RNA-Spezies mit den gewünschten Eigenschaften angereichert. Ein duales Selektionsverfahren erhielt seine Notwendigkeit aus der Tatsache, dass in vitro selektierte Aptamere nicht immer ihre Funktionalität in vivo behalten. Daher wurden die in vitro selektierten TetR-bindenden Aptamere der 12. Selektionsrunde im Anschluß durch ein in vivo screening auf ihre Funktionalität in vivo untersucht. Dazu wurde ein in vivo screening System entwickelt, das drei relevante Komponenten aufweist: 1) ein Reportergen, das downstream von tetO liegt, 2) TetR, der durch Bindung an tetO die Transkription des Reportergens reprimiert und 3) die auf TetR-Bindung hin zu untersuchenden Aptamerspezies der 12. Selektionsrunde. Auf diese Weise wurde das in vivo aktive Aptamer 12-1 gefunden, das in der Lage ist, mit der TetR-Bindung zu interferieren und dadurch als Transkriptionsaktivator des Reportergens zu fungieren. In dieser Arbeit wurde die Aktivität von 12-1 durch Verkürzung der ursprünglichen Sequenz, Stabilisierung der RNA-Struktur und Stringenz des in vivo screening Systems bis zur Sättigung gesteigert. Durch die Verkürzung wurde ein Minimalmotiv von 49 Nukleotiden Länge (12-1M) identifiziert. Das Aptamer besteht aus einer Stammschleifenstruktur, die von einer internen Schleife unterbrochen wird. Beide Stammregionen sind für die Stabilität des Aptamers von Bedeutung. Deren Stabilisierung durch Verlängerung und Mutationen in GC-Basenpaare resultierte in dem aktivsten Konstrukt 12-1R. Durch biochemische Analysen konnte die durch den mfold web server berechnete Struktur des Aptamers bestätigt und die Lokalisation der Bindestelle für TetR auf der RNA eingegrenzt werden. So wurde durch saturierende Mutagenese, enzymatische Strukturanalyse und footprint Experimente bestätigt, dass der für die TetR-Bindung und damit für die Aktivität relevante Bereich des Aptamers in der internen Schleife lokalisiert ist. Durch saturierende Mutagenese des TetR und Fluoreszenztitrationsspektroskopie konnte die DNA-Bindedomäne des Repressors als Kontaktstelle zum Aptamer identifiziert werden. Darauf folgende EMSA-Analysen zeigten, dass das Aptamer in der Lage ist, tetO kompetitiv zu hemmen. Der Kontaktbereich innerhalb der DNA-Bindedomäne konnte auf den Bereich der DNA-Bindeköpfe eingegrenzt werden. Die Wirkungsweise des Aptamers 12-1 beruht somit auf einem Interferenz-basierten Mechanismus von tetO durch das Aptamer.Aptamers are short RNA-molecules selected from huge combinatorial libraries by in vitro selection which bind ligands with high affinity and specificity. In the last two decades their significance as tools for gene regulation, the analysis of molecule interaction and in diagnostics as an alternative to antibodies has increased steadily. In this work it was examined whether the function of a bacterial repressor could be affected by a small endogenously expressed RNA. The tetracycline repressor (TetR) served as the target and binds as a dimer to its specific DNA operator sequence tetO, thus repressing transcription of tetracycline resistance genes. In former experiments a TetR binding RNA aptamer was identified by in vitro selection. The initial library consisted of a 50 nucleotide long randomized sequence flanked by constant regions. RNA species with favoured properties were enriched by 12 cycles of in vitro transcription, selection and reverse transcription. Because in vitro selected aptamers need not necessarily to be functional in vivo, a two-step selection method was used to yield in vivo active aptamers. Therefore, the in vitro selected TetR binding aptamers of cycle 12 were examined by an in vivo screening regarding their in vivo functionality. The screening system consisted of three relevant components: 1) a reporter gene downstream of tetO, 2) TetR which represses transcription of the reporter gene by binding to tetO and 3) the aptamer species of cycle 12, which were to be examined upon TetR binding. Thus the in vivo active aptamer 12-1 was found that interferes with TetR binding and thereby acts as a transcriptional activator of the reporter gene. Here the activity of 12-1 was increased to saturation by truncation of the original sequence, stabilizing the RNA structure and stringency of the in vivo screening system. A minimal motif (12-1M) of 49 nucleotides in length was identified by truncation. The aptamer consists of a stem-loop structure separated by an extended internal loop region. Both stem regions are important for stability of the aptamer. Their stabilization by elongation and mutation in GC base pairs resulted in the most active construct 12-1R. The computational derived structure of the aptamer was verified and the TetR binding site of the RNA was localized by biochemical analysis. Saturating mutagenesis, enzymatic probing and footprints confirmed the bulge as the relevant region for TetR binding and therefore for the activity. The DNA binding domain of the repressor could be identified as contacting surface to the aptamer by saturating mutagenesis and fluorescence titration spectroscopy. EMSA analysis showed competition of tetO by the aptamer. Thus the mode of action of the aptamer 12-1 is based on competitive binding between RNA and DNA

An RNA aptamer that induces transcription.

We identified an RNA aptamer that induces TetR-controlled gene expression in Escherichia coli when expressed in the cell. The aptamer was found by a combined approach of in vitro selection for TetR binding and in vivo screening for TetR induction. The smallest active aptamer folds into a stem-loop with an internal loop interrupting the stem. Mutational analysis in vivo and in-line probing in vitro reveal this loop to be the protein binding site. The TetR-inducing activity of the aptamer directly correlates with its stability and the best construct is as efficient as the natural inducer tetracycline. Because of its small size, high induction efficiency, and the stability of the TetR aptamer under in vivo conditions, it is well suited to be an alternative RNA-based inducer of TetR-controlled gene expression

An RNA Aptamer that Induces Transcription

We identified an RNA aptamer that induces TetR-controlled gene expression in Escherichia coli when expressed in the cell. The aptamer was found by a combined approach of in vitro selection for TetR binding and in vivo screening for TetR induction. The smallest active aptamer folds into a stem-loop with an internal loop interrupting the stem. Mutational analysis in vivo and in-line probing in vitro reveal this loop to be the protein binding site. The TetR-inducing activity of the aptamer directly correlates with its stability and the best construct is as efficient as the natural inducer tetracycline. Because of its small size, high induction efficiency, and the stability of the TetR aptamer under in vivo conditions, it is well suited to be an alternative RNA-based inducer of TetR-controlled gene expression