Distinctive molecular signaling in triple-negative breast cancer cell death triggered by hexadecylphosphocholine (miltefosine)

AbstractThis study describes the molecular signaling involved in the different cell death modes of triple-negative breast cancer cells induced by hexadecylphosphocholine (HePC/miltefosine), a clinically relevant anticancer alkylphosphocholine. We found that the HePC treatment triggers cell-type-dependent apoptotic and non-apoptotic cell death processes. Moreover, the expression level of the apoptosis activator Fas, and Fas/Fas ligand signaling capacity are not attributing factors for the preference toward apoptosis. Using Fas siRNA and overexpression approaches we establish that Fas is not a pro-apoptotic factor but a contributor to cell protection in HePC-apoptosis-sensitive cells. The insight in the multi-modal anticancer capability of HePC in triple-negative breast cancer cells may facilitate the targeted design of therapeutic strategies against triple-negative breast cancers

The CD95 Receptor: Apoptosis Revisited

CD95 is the quintessential death receptor and, when it is bound by ligand, cells undergo apoptosis. Recent evidence suggests, however, that CD95 mediates not only apoptosis but also diverse nonapoptotic functions depending on the tissue and the conditions

Régulation de l'activité de Fas ligand (rôle des rafts membranaires et clivage)

Fas ligand (FasL) peut induire une signalisation de mort ou de survie/prolifération dans les cellules exprimant Fas, et une signalisation réverse peu définie à présent. Fas étant exprimé de façon ubiquitaire et constitutive en surface des cellules, l exposition de FasL à Fas et son activité doivent être étroitement régulées. Une fois adressé à la membrane plasmique, FasL peut être clivé, libérant l ectodomaine de FasL dans le milieu extracellulaire. FasL soluble étant généralement moins toxique que FasL membranaire, il a été proposé que le clivage constitue un moyen de réguler négativement son activité cytotoxique. Au cours de ma thèse, j ai étudié d autres moyens mis en œuvre par la cellule pour moduler ce signal. Nous avons tout d abord examiné le rôle que pouvaient jouer les rafts, des structures membranaires enrichies en sphingolipides et cholestérol, dans l activité cytotoxique de FasL. En collaboration avec l équipe de M. Zörnig (Frankfurt, Allemagne), nous avons montré qu une proportion de FasL est constitutivement associée aux rafts membranaires et que cette localisation est nécessaire pour induire efficacement un signal de mort. Nous avons ensuite montré que FasL pouvait subir deux clivages consécutifs. Un premier clivage par ADAM10 génère deux types de fragments, FasL soluble libéré en extracellulaire, et un fragment membranaire N-ter nommé APL (Adam10-processed Fas ligand). APL est ensuite clivé par SPPL2a, libérant le domaine cytoplasmique de FasL (ou SPA, SPPL2A-processed APL) dans le cytoplasme. Des résultats préliminaires suggèrent que SPA migre dans le noyau où il pourrait moduler la transcription de certains gènes. Le clivage pourrait ainsi être impliqué dans une signalisation réverse de FasL.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Dissection des événements proximaux dans les signaux de mort cellulaire engendrés par les récepteurs Fas et DCC (rôles des microdomaines membranaires et de la palmytoylation)

Fas (CD95), prototype de la superfamille des TNFRs (tumor necrosis factor receptor), est un des récepteurs phare initiant la mort cellulaire. La plupart des cellules tumorales humaines présentent des modifications d'expression de Fas et/ou de son ligand et les traitements utilisés lors des thérapies anti-cancéreuses ont été montrés liés à une activité de ce récepteur. Récemment, de nouveaux signaux non-apoptotiques engendrés par Fas (i.e. NF- B) ont pu être dévoilés qui, contrairement aux signaux de mort cellulaire, demeurent toujours fonctionnels dans les cellules tumorales. L'objectif principal de notre équipe est de disséquer les mécanismes membranaires proximaux contrôlant l'équilibre entre les voies apoptotiques et non-apoptotiques initiées par Fas afin de restaurer la mort de la cellule tumorale. Ce travail a permis de mettre en évidence le rôle crucial de régions particulières de la membrane plasmique appelées "rafts" dans la signalisation de Fas. Nous avons pu également montrer que (i) l'association de Fas avec la protéine ezrine est une des étapes clé initiant l'internalisation du récepteur suite à l'engagement par son ligand et que cette étape est non seulement nécessaire au signal de mort mais la condition de la formation du "death-inducing signaling complex" ; (ii) l'association Fas/ezrine dépend de la palmitoylation de Fas; (iii) les voies non-apoptotiques générées par Fas contrairement aux voies conduisant à la mort seraient indépendantes de l'internalisation du récepteur : cette étape pourrait ainsi faire de la dissection moléculaire des éléments régulant cette internalisation (et des drogues pouvant y être associées) des outils thérapeutiques majeurs.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

The Fas/CD95 Receptor Regulates the Death of Autoreactive B Cells and the Selection of Antigen-Specific B Cells

International audienceCell death receptors have crucial roles in the regulation of immune responses. Here we review recent in vivo data confirming that the Fas death receptor (TNFSR6) on B cells is important for the regulation of autoimmunity since the impairment of only Fas function on B cells results in uncontrolled autoantibody production and autoimmunity. Fas plays a role in the elimination of the non-specific and autoreactive B cells in germinal center, while during the selection of antigen-specific B cells different escape signals ensure the resistance to Fas-mediated apoptosis. Antigen-specific survival such as BCR or MHCII signal or coreceptors (CD19) cooperating with BCR inhibits the formation of death inducing signaling complex. Antigen-specific survival can be reinforced by antigen-independent signals of IL-4 or CD40 overproducing the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family proteins

Identification de nouvelles étapes critiques dans les phases précoces et tardives de la signalisation par Fas (rôle de la phosphorylation des tyrosines et formation de complexes de Fas)

Fas is a prototypic death receptor of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. It is constitutively expressed in a wide range of tissues and plays a particularly important role in the lymphocyte homeostasis. Upon engagement by its ligand (FastL), it undergoes rapid internalization, whereupon the adapter FADD and the caspase-8 proenzyme are recruited to form the death-inducing signalling complex (DISC), leading to caspase activation and cell death. Accumulating evidence suggests that Fas, besides being a death-inducing receptor, can also mediate a variety of non-death activities. However the precise molecular mechanism of the divergence of these two pathways is not fully understood. This thesis is focused on two different aspects of the Fas signalling in order to gain deeper in sight in its precise regulation. We found that the intracellular tyrosines of Fas are located in important phosphorylation and internalization sorting motives, and therefore focused on the role of the receptor tyrosine phosphorylation. We show that the two tyrosine residues are critical for Fas mediated cell death. However they have different phosphorylation pattern and adaptor recruitments. As important regulators of internalization and downstream signalling, Fas tyrosine phosphorylation pattern might be one of the early events which are responsible for the bifurcation of the cell death and survival pathways. At the execution phase of FasL-induced apoptosis we noticed the formation of distinct SDS-stable Fas complexes. This complex formation occurs downstream of the DISC assembly and requires distinct caspase activities. Subgroup of Fas complexes differ in the requirement for the integrity of actin and microtubular cytoskeleton. Consequently, we identified a novel role of microtubule in the organization of Fas molecules during apoptosis. Altogether, the findings reveal some new steps in the very early and late stages of Fas signalling which contribute to the understanding of its functional versatility.Fas est un récepteur de mort de la superfamille des récepteurs au TNF (TNFR). Il est exprimé constitutivement dans de nombreux tissus et joue un rôle important dans l homéostasie lymphocytaire. Suite à la liaison de son ligand (FasL), il est rapidement internalisé puis recrute les protéines FADD et procaspase-8 pour former le DISC (death-inducing signaling complex), conduisant ainsi à l activation des caspases et la mort de la cellule. De nombreux travaux suggèrent que Fas, en plus d être un récepteur de mort, peut transmettre des fonctions alternatives ou de survie. Or, le mécanisme moléculaire contrôlant l orientation de la signalisation vers ces fonctions n est pas élucidé. Cette thèse est focalisée sur deux aspects différents de la signalisation par Fas afin de préciser ses mécanismes de régulation. Deux tyrosines intracellulaires de Fas sont localisées dans des motifs importants pour la phosphorylation et l internalisation. Nous avons démontré que ces deux résidus ont un rôle critique dans la mort induite par Fas. Cependant, ils ont profil de phosphorylation différent et recrutent différents adaptateurs ? Ainsi, comme d autres importants régulateurs de la signalisation de Fas, son profil de phosphorylation pourrait représenter un des événements précoces responsable de la bifurcation du signal vers des voies de mort ou de survie. Pendant la phase d exécution de la mort par Fas, nous avons observé la formation de différents complexes de Fas stables en présence de SDS. Ceci a lieu en aval du DISC et nécessite l activité des caspases. Ces complexes diffèrent entre eux quant à la nécessité d un cytosquelette d actine et microtubulaire intègre pour leur formation. Ainsi, nous avons identifié un nouveau rôle des microtubules dans l organisation des molécules de Fas pendant l apoptose. L ensemble de ces résultats a é=révélé certaines nouvelles étapes dans les phases très précoces et tardives de la signalisation par Fas et qui contribuent à la compréhension de la versatilité fonctionnelle de Fas.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Detection of S-acylated CD95 by acyl-biotin exchange

International audienceS-acylation is the covalent addition of a fatty acid, most generally palmitate onto cysteine residues of proteins through a labile thioester linkage. The death receptor CD95 is Spalmitoylated and this post-translational modification plays a crucial role on CD95 organization in cellular membrane and thus on CD95-mediated signaling. Here, we describe the non-radioactive detection of CD95 S-acylation by acyl-biotin exchange chemistry in which a biotin is substituted for the CD95-linked fatty acid. This sensitive technique, which depends on the ability of hydroxylamine to specifically cleave the thioester linkage between fatty acids and proteins, relies on 3 chemical steps: (i) blockage of free thiols of non-modified cysteine residues, (ii) hydroxylamine-mediated cleavage of thioester-linked fatty-acids to restore free thiols and (iii) biotinylation of free thiols with a thiol reactive biotinylation agent. Resulting biotinylated proteins can be easily purified by an avidin capture and analysed by SDS-PAGE and immunoblotting

La mort cellulaire au service de l’homéostasie épithéliale

International audience> Le tissu épithélial constitue à la fois une barrière entre deux environnements et un lieu d'échanges de molécules. Ces fonctions sont assurées grâce à l'orga-nisation structurale des cellules épi-théliales jointives, qui établissent des contacts entre elles, mais aussi avec la matrice extracellulaire (MEC) sous-jacente. Ces contacts vont permettre d'établir une polarité cellulaire, en défi-nissant un domaine latéral (en contact avec les cellules voisines), un domaine basal (en contact avec la MEC), et un domaine apical (en contact avec des cel-lules supra-basales dans le cas d'un épi-thélium stratifié, ou exposé à la lumière d'un organe creux dans le cas d'un épi-thélium simple) (Figure 1). Les contacts cellulaires sont assurés par différents types de protéines présentes à la surface cellulaire, telles que les intégrines et les cadhérines, qui sont respectivement impliquées dans les contacts entre la cel-lule et la MEC et entre cellules voisines. La mise en place de ces contacts définit une polarité cellulaire apico-basale, dont le maintien est indispensable au dévelop-pement, à l'homéostasie et à l'intégrité fonctionnelle des tissus épithéliaux. La polarité apico-basale permet notamment la localisation de protéines membra-naires dans un domaine spécifique de la cellule épithéliale