Analyse fonctionnelle, cellulaire et moléculaire des effets du stress oxydatif sur l'homéostasie calcique du muscle dystrophique

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire affectant environ 1 garçon sur 3500. Elle est due à des mutations dans le gène codant pour la dystrophine, protéine de 420 kDa identifiée en 1987, localisée sous la membrane de la fibre musculaire. Une perturbation de l homéostasie calcique est l un des mécanismes impliqués dans le processus physiopathologique de cette maladie. Cependant, l absence de la dystrophine induit également la délocalisation de l enzyme NO-synthase provoquant une diminution de la libération de NO, ce qui pourrait être à l origine de l accumulation de radicaux libres, inducteurs potentiels de la nécrose musculaire. Le but de ce travail a donc été d étudier le rôle du stress oxydatif dans le processus dystrophique musculaire du diaphragme de souris mdx, modèle animal de la DMD, et tout particulièrement sur les mécanismes participant à la régulation du Ca2+ intracellulaire. Ainsi, les effets potentiels d oxydants tels que le peroxyde d hydrogène (H2O2) et l acide hypochlorique (HOCl) ont été analysés sur les structures impliquées dans la fonction musculaire telles que les myofilaments et le réticulum sarcoplasmique, organite impliqué dans la régulation du Ca2+ et apparaissant aussi comme des cibles privilégiées de l oxydation cellulaire. Les résultats obtenus sur le modèle de fibres perméabilisées au triton X-100 montrent que seul HOCl induit une augmentation de la sensibilité au Ca2+ des protéines contractiles. L analyse des contractures induites par l activation des récepteurs à la ryanodine par la caféine sur le modèle de fibres perméabilisées à la saponine montre que H2O2 et HOCl induisent une diminution des contractures développées traduisant une diminution de la quantité de Ca2+ libérée, ces effets étant significativement plus importants pour le muscle dystrophique. Lors d approches conduites sur des vésicules de réticulum sarcoplasmique, la sensibilité accrue des muscles dystrophiques à l action des oxydants a été également mise en évidence. Ainsi, dans ces cellules squelettiques de diaphragme où la dystrophine est absente, nos résultats montrent que les oxydants peuvent altérer la fonction contractile par une action au niveau des mécanismes cellulaires impliqués dans le contrôle du Ca2+, suggérant à nouveau l implication d un stress oxydatif dans le processus dystrophique et son association étroite avec la perturbation de l homéostasie calcique. Aucun traitement curatif de la myopathie de Duchenne est actuellement disponible, seule la prescription de stéroïdes comme traitement palliatif permet de ralentir la maladie mais comporte de nombreux effets secondaires. La suite de l étude a donc été consacrée à l analyse des effets bénéfiques potentiels de traitements pharmacologiques. Les souris mdx traitées à base de créatine ou de L-arginine montrent une récupération de certaines fonctions motrices associée à une amélioration de la fonction de charge en Ca2+ du réticulum sarcoplasmique. Ces résultats démontrent l importance de cet organite dans le contrôle du Ca2+ du muscle dystrophique. Les protéines impliquées dans la régulation du Ca2+ apparaissent donc comme des cibles privilégiées dans le cadre de la mise en place de nouveaux traitements de la DMDDuchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by necrosis and progressive muscle weakness. In DMD patients and mdx mouse model, dystrophin deficiency lead to altered total Ca2+ content but also to an oxidative stress. This study examine the direct effect of oxidant on the contractile apparatus and sarcoplasmic reticulum (SR) function in diaphragm from mdx mice. Exposing triton skinned fibres to H2O2 or HOCl induced a decrease of tension. Data from saponin skinned fibres and SR vesicles show that oxidant slowing-down the SR Ca2+ uptake. Furthermore, mdx muscle was more affected by H2O2, suggesting that oxidant could been implicated in alteration of Ca2+ homeostasis via disruption of SR function. A second part of this study investigated the potential benefits of pharmacological tools in reversing the Ca2+ sequestration function of SR. Creatine or L-arginine treated mdx mice show an improvement of motor capacity, of cellular contractile function and particularly of the SR Ca2+ uptake. Taken together, these data show the importance of SR function in Ca2+ regulation in dystrophic muscle.NANTES-BU Sciences (441092104) / SudocSudocFranceF

Rôle des mécanismes intracellulaires de régulation du calcium dans la dystrophie musculaire de Duchenne (approche physiologique, pharmacologique et moléculaire)

Le but de ce travail est d'étudier les fonctions du réticulum sarcoplasmique (RS) des muscles EDL et soléaire de souris mdx. Les résultats montrent, dans les deux types de muscles, un ralentissement de la charge en Ca2+ sans modification de la capacité maximale de stockage. Une altération des mécanismes de charge pourrait impliquer la Ca2+-ATPase et/ou la présence d'une fuite passive de Ca2+. Les résultats issus d'approches physiopharmacologiques, biochimiques et moléculaires indiquent, dans l'EDL mdx, une diminution de la sensibilité à un inhibiteur de la Ca2+-ATPase du RS, associée à l'expression de son isoforme lente SERCA2a. Dans le soléaire mdx seule une importante fuite de Ca2+ du RS a été observée, impliquant les canaux calciques : récepteurs à la ryanodine et à l'inositol triphosphate. Ces résultats soulignent le rôle majeur du RS dans la perturbation de l'homéostasie calcique des cellules musculaires dystrophiques impliquant différents mécanismes selon le type musculaire.NANTES-BU Sciences (441092104) / SudocSudocFranceF

Cyclopiazonic acid-induced changes in the contraction and Ca 2+ transient of frog fast-twitch skeletal muscle

International audienceThe effects of cyclopiazonic acid (CPA) were investigated on isolated skeletal muscle fibers of frog semitendinosus muscle. CPA (0.5-10 microM) enhanced isometric twitch but produced little change in resting tension. At higher concentrations (10-50 microM), CPA depressed twitch and induced sustained contracture without affecting resting and action potentials. In Triton-skinned fibers, CPA had no significant effect on myofibrillar Ca2+ sensitivity but decreased maximal activated force at concentrations > 5 microM. In intact cells loaded with the Ca2+ fluorescence indicator indo 1, CPA (2 microM) induced an increase in Ca(2+)-transient amplitude (10 +/- 2.5%), which was associated with an increase in time to peak and in the time constant of decay. Consequently, peak force was increased by 35 +/- 4%, and both time to peak and the time constant of relaxation were prolonged. It is concluded that CPA effects, at a concentration of up to 2 microM, were associated with specific inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-adenosinetriphosphatase in intact skeletal muscle and that inhibition of the pump directly affected the handling of intracellular Ca2+ and force production

Immunological characterization of dystrophin-deficient Dmd[mdx] rats

International audienc

Immunological characterization of a rat model of Duchenne’s disease and increase in muscle strength after anti-CD45RC antibody treatment

International audienceIn this study, we phenotyped by flow cytometry and immunohistochemistry (data not shown) the immune cell subsets infiltrating Dmd mdx rat skeletal and cardiac muscles. Leukocyte infiltrates were absent or very low at 2 weeks of age, peaked at 4 and 8 weeks and decreased at 12 weeks. M2 macrophages represented >90% of infiltrating immune cells and Teff cells were the majority of the remaining ones. We also analyzed muscle enzymes and cytokines in sera. Creatin kinase was increased at weeks 4 and 8 and decreased at week 12 and thereafter (data not shown). This results are consistent with those observed in mdx mice model. Anti-CD45RC MAb treatment of young Dmd mdx rats normalized skeletal muscle strength associated to a depletion of effectors CD45RC high cells and no obvious side-effects. As a control prednisolone treatment of Dmd mdx rats similarly increased skeletal muscle strength and was also associated to a depletion of effectors CD45RC high cells but resulted in severe weight loss. Conclusion Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a severe genetic muscle-wasting disorder due to the lack of dystrophin characterized by a progressive muscle weakness and a cardiomyopathy leading to premature death. The dystrophin-deficient Dmd mdx rats were generated using TALENs and offer a more reliable representation of human DMD, with marked muscle strength reduction, cardiomyopathy and muscle fibrosis that are higher that those observed in the mdx mouse model (1). A role for inflammation and autoimmune responses in muscle damages was shown both in DMD patients and the mdx mouse model (2).In this study, we assessed by flow cytometry and immunohistochemistry the immune cell subsets infiltrating Dmd mdx rat skeletal and cardiac muscles especially immunoregulatory and pro-inflammatory subsets (M1 and M2 macrophages, CD4 + and CD8 + Teff or Tregs…).Then, we investigated the possibility of reducing disease in Dmd mdx rats by administrating immunomodulatory treatments. The standard therapy for DMD patients is corticoids that decrease inflammation and immune responses but with variable responses, limited efficacy and important and numerous side effects. Therefore, there is need for new anti-inflammatory and pro-tolerogenic treatments that could replace or decrease the doses of corticoids. Anti-CD45RC monoclonal antibody (MAb) treatment has induced immune tolerance in models of organ transplantation and GVHD

Increased Ca2+ storage capacity of the skeletal muscle sarcoplasmic reticulum of transgenic mice over-expressing membrane bound calcium binding protein junctate

Junctate is an integral sarco(endo)plasmic reticulum protein expressed in many tissues including heart and skeletal muscle. Because of its localization and biochemical characteristics, junctate is deemed to participate in the regulation of the intracellular Ca2+ concentration. However, its physiological function in muscle cells has not been investigated yet. In this study we examined the effects of junctate over-expression by generating a transgenic mouse model which over-expresses junctate in skeletal muscle. Our results demonstrate that junctate over-expression induced a significant increase in SR Ca2+ storage capacity which was paralleled by an increased 4-chloro-m-cresol and caffeine-induced Ca2+ release, whereas it did not affect SR Ca2+-dependent ATPase activity and SR Ca2+ loading rates. In addition, junctate over-expression did not affect the expression levels of SR Ca2+ binding proteins such as calsequestrin, calreticulin and sarcalumenin. These findings suggest that junctate over-expression is associated with an increase in the SR Ca2+ storage capacity and releasable Ca2+ content and support a physiological role for junctate in intracellular Ca2+ homeostasis