A Dnmt3b DNS metiltranszferáz tetraciklinnel szabályozott túltermelésének hatása transzgénikus egerekben = The effect of tetracycline regulated overexpression of Dnmt3b methyltransferase in transgenic mice

Kísérleteim során a Dnmt3b DNS metiltranszferázt próbáltam túltermeltetni transzgénikus egérmodellben. A túltermelést szabályozott módon, tetraciklin regulációval, illetve a megfelelő Dnmt3b funkcionális mRNS szabályozott időpontban történő mikroinjektálásával próbáltam elérni. A gén megjelenésének időpontját úgy választottam meg, hogy az lehetőség szerint megzavarja a korai embrionális korban történő metilációs mintázat kialakulását. A kísérletekben a Dnmt3b nem tartalmazta az un. CPE motívumot, így lehetősége van a fehérjének közvetlenül hatni a korai embrionális korban is. A létrehozott transzgénikus egér szabályozott módon, de nagyon alacsony mértékben expresszálta a transzgént. Így nem volt kimutatható szerepe a DNS metilációra sem globális szinten, sem a H19 és Snrpn gének esetében. A mikroinjektált RNS esetében sem sikerült a kis szatellit szekvenciák metiláltságában különbséget találni, azonban a H19 gén megfelelő régiójában enyhe hipermetiláció alakult ki a felnőtt állatok májában. | In my experiments I tried to overexpress the human Dnmt3b DNA methyltransferase in transgenic mouse models. Overexpression was regulated by tetracyclin or by the perfect microinjection timing of functional Dnmt3b mRNA. The temporary appearance of gene expression was formed due to disturb the developing methylation pattern in the early embryonic stages. The nucleic acid constructs created do not contain the special CPE motifs so the recombinant protein can directly act in the early embryonic stages. The transgenic mouse line generated expresses the transgene in a regulated way but expression was extremely weak. We could not show any DNA hypermethylation not at global genomic level nor in the cases of H19 and Snrpn genes. The specially microinjected RNA did not changed the methylation status of centromeric minor satellite sequences, but slight hypermethylation occurred in H19 DMR region of the liver DNA

Neuronális és extraneuronális aminerg receptorok jellemzése gerinctelenekben = Characterization of neuronal and extraneuronal aminergic receptors in invertebrates

Radioaktív ligandok kötődésével vizsgáltuk az acetilkolin, szerotonin és dopamin receptorokat Lymnaea CNS-ben. A kolinerg ligandok kötődése nikotin és muskarin receptorok jelenlétét igazolták a CNS-ben. Nem kötődtek specifikusan és nagy affinitással az 5HT receptorok ligandjai és mérsékelt affinitású a dopamin receptor ligand kötődese. Az 3H-LSD az egyetlen ligand mely nagy affinitással kötődött mind a szerotonin, mind a dopamin receptorhoz. A kolinerg receptorok az evolúció során konzerválódtak, míg a szerotonin és dopamin receptorok gerincesekre jellemző típusai nem találhatók meg a puhatestűek idegrendszerében. A szárazföldi csigák a száraz meleg periódusokat inaktív "nyári álom" állapotban élik át. Ekkor metabolitikus aktivitásuk az aktív periódusra jellemzőnek csak a 20-30 %-a. Kísérleteinkben vizsgáltuk, hogy hogyan szabályozza a szerotonin és a dopamin az aktivációs/inaktivációs folyamatokat. Helix pomatia-ban. HPLC-s vizsgálatokkal kimutattuk, hogy az aktiváció során az idegrendszerben a MA szintje csökken, míg a szív és a talpizomban nő és szerotonin túlsúly alakul ki. A meg növekedett szerotonin szint az adenil cikláz stimulációja révén növelte a szövetek cAMP koncentrációját. A cAMP szint növekedése a protein kinazA aktivitásának serkentését eredményezte. A protein kinazA foszforilációval növelte egy 600 és egy 50 kDa molekulatömegű fehérje mennyiségét a szövetekben, melyek jelentős szereppel bírnak az izom kontrakciójának/relaxációjának szabályozásában. | We characterized acetylcholine, serotonin and dopamine receptors in the Lymnaea brain, using 3H-ligand binding methods. The ligands of cholinergic receptors bound with high affinity to the Lymnaea CNS and pharmacological properties of the binding suggest the presence of both nicotinic and muscarinic receptor types. No specific, high affinity binding of 5HT receptor ligands were found. The selective dopamine D1 and D2 receptors bound to the Lymnaea CNS with moderate affinity. The 3H-LSD was the single ligand displaying a high affinity binding to both serotonin and dopamine receptors. Terrestial snails are aestivated for several weeks, when the surrunding humidity becomes low. During this dormant state the overall metabolic rate depressed to a level of only 20-30 % of that of active snails. Our aim was to study how 5HT and DA are involved in the regulation of activatio/inactivation process in Helix pomatia. HPLC assay show that in Helix heart and foot there is a 5HT dominance and this dominance became more significant in active animals. The increased level and dominance of 5HT resulted in a increase of the concentration of cAMP by stimulating the adenylate cyclase. The high cAMP concentration stimulated the cAMP dependent protein kinaseA activity resulting in the phosphorylation a high (600 kDa) and a low (50 kDa) molecular weight protein involved in the regulation of the relaxation/contraction of the muscle

A nyúl neonatális FC receptor klónozása, jellemzése = Cloning and characterisation of the rabbit neonatal FC receptor

Az emlősök szervezetében található immunglobulinok közül legjelentősebb az IgG, mely a fertőzésekkel szemben biztosít védelmet. A neonatális Fc receptor (FcRn) dimer molekula, nehéz lánca az MHC-I osztályú fehérjékhez tartozik. A molekula részt vesz az anyai IgG utódoknak történő átadásában, a szérum IgG szintjének fenntartásában, és az immunválaszban –fagocitózisban és antigén prezentációban. A főemlősökhöz hasonlóan nyúlban az anyai immun transzport folyamatok a magzati korban történnek a szikzacskón keresztül. Bár a nyúlban a transzport folyamatát már vizsgálták, a receptor molekulát még nem klónozták és jellemezték. Hogy pontosan megértsük a nyúlban, mint modellállatban az FcRn működését RACE PCR-el klónoztuk a nyúl FcRn nehéz láncát és jellemeztük. Megállapítottuk, hogy nagy hasonlóságot mutat az ismert emlős ortológokhoz. Részletesen vizsgáltuk a gén expresszióját a placentában, az amnionban és a szikzacskóban. A receptor megjelenik a placenta kapilláris endotél sejtjeiben és a szikzacskó endoderm sejtek apikális régiójában. RNS szinten kimutattuk jelenlétét monocitákban és makrofágokban is. Megállapítottuk, hogy a nyúl FcRn pH függő módon működik. A fenti vizsgálatok igazolják, hogy az általunk klónozott és jellemzett receptor a nyúl FcRn. | IgG is the most important immunoglobulin in mammals. IgG protects against infections. The neonatal Fc receptor (FcRn) is a dimer its heavy chain is similar in structure to MHC class I proteins. Multiple functions have been shown for neonatal Fc receptor, as it mediates maternal transfer of IgG to offsprings, responsible for the maintenance of serum IgG level and plays an important role in immune respons-phagocytosis and antigen presentation. Like primates, rabbit maternal IgG transport occurs during the fetal life and mediated by the FcRn through the yolk sac. Although, there were several studies in analyzing IgG transport in rabbit yolk sac, the rabbit FcRn has not been cloned and analyzed so far. In order to have a better understanding in this valuable model, first we cloned the rabbit FcRn using RACE PCR and found that the coding region of the rabbit FcRn alpha-chain shows high similarity to the other mammalian orthologues. We also characterized the rabbit FcRn by detecting its expression in monocytes, macrophages, fetal placenta, yolk sac and amnion, though this last one presented less FcRn expression, by RT-PCR. We detected this receptor in the endothelial cells of the placental capillaries as well as in the apical region of endoderm cells in the yolk sac. We found that the rabbit FcRn, binds IgG in a pH dependent manner, like its other mammalian FcRns. These results confirm that the rabbit Fc receptor in the rabbit yolk sac is a bona fide FcRn receptor

Inter- és intracelluláris jelátviteli mechanizmusok tér- és időbeli szerveződése gerinctelenek idegrendszerében = Spatial and temporal organization of inter- and intracellular signaling pathways in the nervous system of invertebrates

Inter- és intracelluláris hírvivő rendszerek szerveződésének kémiai-neuroanatómiai, hisztokémiai, neurokémiai és funkcionális jellemzőit vizsgáltuk az összehasonlító neurobiológia két gastropoda modellállatában (Lymnaea stagnalis, Helix pomatia). i) Azonosítottuk a vesztibuláris érzékszervben, a statocystában (Lymnaea) a szenzoros sejtek projekciós rendszerét, térbeli elrendeződésükett, kémiai hírvivőiket és szinaptikus bemeneteiket. ii) Azonosítottuk a glutamáterg rendszer központi és perifériás elemeit a felnőtt és fejlődő Lymnaea idegrendszerében, valamint a glutamát transzporterek (VGluT, EAAT) funkcionális jellemzőit, molekuláris szerkezetét és mRNS transzkripcióját. iii) Igazoltuk aminerg (szerotonin, dopamin) rendszerek meghatározó szerepét a Lymnaea egyedfejlődésének menetében és felnőttkori magatartásformáinak érésében. iv) Kimutattuk a pofaizomzatban a szerotonerg innerváció és az izomrendszer párhuzamos érését, továbbá azonosítottuk a periféria (pofa- és talpizomzat) szerotonerg szabályozásának cAMPhez kapcsolt 5HT6-receptorát, illetve az embrionális forgómozgás 5-HT1A receptorát. v) Azonosítottuk és molekuláris szinten differenciáltuk a felnőtt és fejlődő központi idegrendszer szerveződésében meghatározó szerepet játszó extracelluláris matrix komponenseket. Eredményeink hozzájárulnak a neuronális szignalizációt, illetve magatartásformákat meghatározó celluláris folyamatok, továbbá az idegi szabályozás kémiai és molekuláris eseményeinek pontosabb megismeréséhez. | Chemical-neuroanatomical, histochemical, neurochemical and functional organization of inter- and intracellular signaling systems were investigated in two model gastropod species of comparative neurobiology (Lymnaea stagnalis, Helix pomatia). i) Projection pattern, chemical heterogeneity and spatial distribution of the sensory hair cells of the vestibular organ (statocyst) of Lymnaea were identified. ii) Distribution and organization of the central and peripheral elements of the glutamatergic system in the adult and developing Lymanea were described, and the transporters (VGluT, EAAT) were cloned, in situ hybridized and functionally characterized. iii). The pivotal role of aminergic (serotonin, dopamine) systems in the embryogenesis and maturation of adult-like behaviors of Lymnaea was proven. iv) Timing and spatial organization of serotonergic innervation and buccal muscle development during Lymanea ontogenesis, as well as the serotonergic receptor cascade involved in feeding and locomotion (5-HT6-cAMP), and intracapsular rotation (5-HT1A-cAMP) was revealed. v). Extracellular matrix components playing a determining role in CNS organization and plastic events were identified and differentiated according to their molecular composition in adult and developing gastropods. The results contribute to a better understanding of neuronal signaling and regulatory processes underlying different behaviors, and to further analyze the chemical and molecular events of neuronal regulations

Neuromoduláció sejtszintű mechanizmusainak vizsgálata ideg-izom és ideg-mirigy kapcsolatokban. = Cellular mechanisms of the neuromodulation in neuromuscular and neuroglandular junctions.

Az éticsiga nyálmirigy jó modell az ideg-izom, ideg-mirigy szinapszis és a szekréció molekuláris mechanizmusának a tanulmányozásában. A mirigyben négyféle sejttípust azonosítottunk és megállapítottuk, hogy azok száma, eloszlása az aktív és inaktív állatokban eltérő és az ingerületáttevődés nem-szinaptikus úton valósul meg. A varikozitásokban lévő vezikulákból dopamin, szerotonin és neuropeptidek szabadulnak fel. A mirigysejtek közötti gap-junction ill. deszmoszóma kapcsolatok biztosítják a szerv szinkron működését. Leírtuk a mirigysejtek passzív és aktív elektromos tulajdonságait, és a feszültségfüggő ion-konduktanciákat. Jellemeztük a transzmitter receptorokat, amelyek heteromér formában vannak jelen, ily módon egymás hatását antagonizálják. Eredményeink ujabb adatokkal szolgálnak a puhatestüek 5HT receptorainak osztályozásához. A transzmitterhatást számos neuropeptid modulálja, amely csak a puhatestüekben fordul elő, de a PACAP is, melynek jelenlétét és szerepét puhatestűekben kimutattuk. Egy endogén neuropeptid szignalizációs útvonalát vizsgáltuk és megállapítottuk, hogy G-protein kapcsolt és amelyben mindkét disszociált alegység részt vesz és a deszenzitizációt egy protein kináz enzim végzi. A fiziológiai ingerek hatására a cisztikus sejtek száma megnőtt, melyek kivétel nélkül a programozott sejthalál morfológiai és molekuláris jeleit mutatták. Megállapítottuk, hogy a nyálfelszabadulás fiziológiai útja a mitochondrium-kaszpáz mediált útvonal. | The snail salivary gland is a suitable model in studying neuro-muscular, neuro-glandular synapse and the molecular mechanism of salivation. For cell types were identified in the gland and it was found, that distribution and number of different cell types were different in active and inactive snails. Vesicles in varicosities liberate dopamine, serotonin and number of neuropeptides. Gap-junction and desmosome-like structures ensure the synchronization of gland cells. Passive and active electrical properties of cells were examined and voltage-dependent ion currents were characterized. It was found that receptors occur in heterometric form, they bind both DA and 5HT and thereby antagonizing its effect. Our results contribute to the characterization and classification of 5HT-receptors in mollusc. The transmitter effect is modulated by peptides present only in molluscs, and by PACAP occurrence and distribution of which is described in mollusc. Signalling pathway of the neuropeptide (MIP) was studied and found that it is G-protein coupled and both subunits are active and the desensitization of the receptor is performed by receptor kinase. Physiological stimuli such as transmitters or nerve stimulation increased the number of cystic cells. These cells every time revealed a morphological and molecular signs of the programmed cell death. It is concluded, that the mitochondrial-caspase pathway of the programmed cell death is a physiological way of the saliva release

Rescuing Lethal Phenotypes Induced by Disruption of Genes in Mice: a Review of Novel Strategies

Approximately 35 % of the mouse genes are indispensable for life, thus, global knock-out (KO) of those genes may result in embryonic or early postnatal lethality due to developmental abnormalities. Several KO mouse lines are valuable human disease models, but viable homozygous mutant mice are frequently required to mirror most symptoms of a human disease. The site-specific gene editing systems, the transcription activator-like effector nucleases (TALENs), Zinc-finger nucleases (ZFNs) and the clustered regularly interspaced short palindrome repeat-associated Cas9 nuclease (CRISPR/Cas9) made the generation of KO mice more efficient than before, but the homozygous lethality is still an undesired side-effect in case of many genes. The literature search was conducted using PubMed and Web of Science databases until June 30(th), 2020. The following terms were combined to find relevant studies: “lethality”, “mice”, “knock-out”, “deficient”, “embryonic”, “perinatal”, “rescue”. Additional manual search was also performed to find the related human diseases in the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) database and to check the citations of the selected studies for rescuing methods. In this review, the possible solutions for rescuing human disease-relevant homozygous KO mice lethal phenotypes were summarized

Transposon-Based Reporter Marking Provides Functional Evidence for Intercellular Bridges in the Male Germline of Rabbits

K

The potential impact of new generation transgenic methods on creating rabbit models of cardiac diseases

Since the creation of the first transgenic rabbit thirty years ago, pronuclear microinjection remained the single applied method and resulted in numerous important rabbit models of human diseases, including cardiac deficiencies, albeit with low efficiency. For additive transgenesis a novel transposon mediated method, e.g., the Sleeping Beauty transgenesis, increased the efficiency, and its application to create cardiac disease models is expected in the near future. The targeted genome engineering nuclease family, e.g., the zink finger nuclease (ZFN), the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and the newest, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) with the CRISPR associated effector protein (CAS), revolutionized the non-mouse transgenesis. The latest gene-targeting technology, the CRISPR/CAS system, was proven to be efficient in rabbit to create multi-gene knockout models. In the future, the number of tailor-made rabbit models produced with one of the above mentioned methods is expected to exponentially increase and to provide adequate models of heart diseases