Nucleosomes protect DNA from DNA methylation in vivo and in vitro

Positioned nucleosomes limit the access of proteins to DNA. However, the impact of nucleosomes on DNA methylation in vitro and in vivo is poorly understood. Here, we performed a detailed analysis of nucleosome binding and nucleosomal DNA methylation by the de novo methyltransferases. We show that compared to linker DNA, nucleosomal DNA is largely devoid of CpG methylation. ATP-dependent chromatin remodelling frees nucleosomal CpG dinucleotides and renders the remodelled nucleosome a 2-fold better substrate for Dnmt3a methyltransferase compared to free DNA. These results reflect the situation in vivo, as quantification of nucleosomal DNA methylation levels in HeLa cells shows a 2-fold decrease of nucleosomal DNA methylation levels compared to linker DNA. Our findings suggest that nucleosomal positions are stably maintained in vivo and nucleosomal occupancy is a major determinant of global DNA methylation patterns in vivo

Polycystin-2 takes different routes to the somatic and ciliary plasma membrane

Polycystin-2 goes through the Golgi apparatus when going to the plasma membrane, but bypasses it en route to the ciliary membrane

Struktur- und Funktionsanalyse von Polycystin-2

PKD2 ist eines der Gene, die im Falle einer Mutation zur Entstehung der autosomal dominant vererbten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) führen. PKD2 kodiert für ein 968 Aminosäuren umfassendes Membranprotein (PC2), das 6 Transmembrandomänen besitzen soll, wobei der N- und C-Terminus ins Zytoplasma ragen. PC2 fungiert als nicht selektiver Kationen-Kanal in der Membran des ER bzw. des Ziliums. In manchen Zelllinien wird jedoch z.T. auch eine Plasmamembranlokalisation des Volllängen-Proteins berichtet. Bisher sind noch keine Hot-Spots für Mutationen bekannt, so dass noch nicht verstanden ist, wie Mutationen in PKD2 zu ADPKD führen. Daher sollte die Proteinstruktur über Topologie-Studien und NMR-Analysen der C-terminalen Domäne, die für die meisten Protein-Interaktionen von PC2 von Nöten ist, charakterisiert werden. Bindungsstudien mit Interaktionspartnern sollten helfen, die physiologische Relevanz dieser Wechselwirkungen besser beurteilen zu können. Schließlich sollte ein Exportmotiv charakterisiert werden, das zum besseren Verständnis der subzellulären Lokalisation von PC2 beitragen sollte. Um die Orientierung der postulierten Schleifendomänen sowie des N- und C-Terminus zu überprüfen, wurde zunächst eine immunzytochemische Studie mit Polycystin-2-Konstrukten durchgeführt, die in den jeweiligen Schleifendomänen abgeschnitten waren und ein C-terminales Antikörper-Epitop trugen. Die so erhaltenen Daten stehen in Einklang zu dem entworfenen Modell und konnten durch Protease-protection-Assays mit Mikrosomenpräparationen bestätigt werden. Die ER-Retention von PC2-Versionen mit Abbrüchen in Schleifendomäne 1-3 und die Translokation von PC2-Versionen mit Abbrüchen in Schleifendomäne 4 und 5 zur Plasmamembran deuteten auf die Existenz eines Exportmotivs hin. Durch Alanin-Scanning-Mutagenesestudien in Verbindung mit Biotinylierungs-Assays konnte das Motiv auf 6 Aminosäuren (KLFKFI, AS 572-577) in Schleifendomäne 4 eingegrenzt werden. Die identifizierte Aminosäuresequenz scheint die spezifische Lokalisation von PC2 in der somatischen Plasmamembran zu ermöglichen, wobei einem Lysin-Rest (AS 572) und einem Phenylalanin-Rest (AS 576) eine besondere Rolle beim Export zukommt. Dieser Aspekt legt nahe, dass PC2 auf zwei unabhängigen Wegen zur ziliären bzw. somatischen Plasmamembran gelangt, wobei sich diese vermutlich im Golgi-Apparat trennen, da PC2 und eine (plasmamembranständige) C-terminale Deletionsmutante in Gegenwart von entsprechenden �Transport-Inhibitoren� nicht mehr ins Zilium gelangen. Endo H-Assays deuten an, dass es sich dabei um das Cis-Golgi-Kompartiment handelt. Für die strukturelle Charakterisierung des C-Terminus von PC2 über NMR wurde dieser zweigeteilt (AS 680-796 und AS 797-968) und die entsprechenden Peptide rekombinant hergestellt. Es zeigte sich, dass das größere (AS 797-968) der beiden Peptide homomere Interaktionen eingeht und HSQC-Spektren nach zu urteilen größtenteils unstrukturiert vorliegt. Die HSQC-Spektren des kleineren (AS 680-796) Peptides offenbarten, dass dieses erst spezifisch durch Zugabe von Calcium strukturiert wird, wobei das Peptid dann vornehmlich in Form von alpha-Helices organisiert ist. Während Fluoreszenzspektroskopiemessungen den Hinweis auf ein C-terminales EF-Hand-Motiv (Kd-Wert: 70-90 µM) lieferten, deuteten 1D-Protonenspektren an, dass ein paarweise angeordnetes Helix-Loop-Helix-Motiv des Peptides ein Calcium-spezifisches, sequentiell kooperatives EF-Hand-Paar bildet (Kd-Werte: 161 ± 36 µM und 51 ± 4 µM für N- und C-term. Motiv). Für die Bestimmung der Bindungsparameter der Interaktionen von PC2 mit PIGEA-14 und PC1 über Quarzmikrowaagetechnik wurden C-terminal His-fusionierte Interaktionsdomänen der Bindepartner rekombinant hergestellt, auf einer Nickel-Lipid-Membran immobilisiert und im Anschluss mit dem rekombinant hergestellten C-Terminus von PC2 inkubiert. Für die Wechselwirkung von PC2 mit PC1 bzw. PIGEA-14 ergaben sich Kd-Werte von 46 ± 13 nM bzw. 146 ± 35 nM. Die Kd-Werte der Interaktionen des C-Terminus von PC2 mit PC1, PIGEA-14 und Calcium sprechen somit für deren physiologische Relevanz. Weiterhin besitzt PC2 nachweislich 6 Transmembrandomänen, wobei die N- und C-Termini zytoplasmatisch orientiert sind. Die Identifizierung eines Exportmotivs in Schleife 4 könnte schließlich die in verschiedenen Zelllinien beobachtete unterschiedliche subzelluläre Lokalisation von PC2 erklären. Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit sowohl ein Beitrag zur strukturellen als auch zur funktionellen Charakterisierung von PC2 geleistet. Dies wiederum könnte helfen zu verstehen, inwiefern Mutationen im PKD2-Gen zum Ausbruch von ADPKD führen