Genexpression während des täglichen Torpors: Molekulare Mechanismen der Stoffwechseldepression

Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) zeigen täglichen Torpor als Teil ihrer saisonalen Akklimatisation an die kalte Jahreszeit. Wie viele andere Kleinsäuger senken die Hamster während des Torpors ihre Stoffwechselrate zur Energieeinsparung während der täglichen Ruhephase für mehrere Stunden ab. Die verringerte Eigenwärmeproduktion führt in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur zu einer Erniedrigung der Körpertemperatur (Hypothermie). Verantwortlich für den Eintritt in den hypometabolen Zustand während des täglichen Torpors ist ähnlich wie beim Winterschlaf eine Stoffwechseldepression. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen Untersuchungen zur Genexpression beim Eintritt in den täglichen Torpor. Dabei lag das Interesse sowohl auf der Identifikation differentiell exprimierter Gene, als auch auf der Untersuchung der „globalen“ Transkriptions- und Translationsaktivität, die einen Beitrag zur metabolischen Depression leisten könnten. Die kontinuierliche Messung der Stoffwechselrate mittels indirekter Kalorimetrie ermöglichte die Gewebeentnahme in drei metabolischen Zuständen: Normometabol (Kontrollen), torpid (bei Erreichen der minimalen Stoffwechselrate) und nach dem „Erwachen“ aus dem Torpor (Arousal). Die „globale“ Transkriptionsaktivität in der Leber wurde mittels Transcriptional Run on Assays untersucht. Bei Zellkernen aus der Leber torpider Hamster konnte im Vergleich zu den normometabolen Kontrollen ein um ~40% erniedrigter Einbau radioaktiv-markierter Nukleotide in die in vitro-transkribierten mRNA-Moleküle festgestellt werden. Dies lässt auf eine Reduktion der Initiationsrate von Transkriptionsvorgängen während des Torpors schließen. Die in vitro- Transkriptionsrate der Leber-Zellkerne von Hamstern, die aus dem Torpor wieder erwacht waren (Arousal), unterschied sich nicht von den Proben der normometabolen Kontrolltiere. Zum Vergleich der Proteinsynthese in der Leber normometaboler und torpider Hamster wurden Polysomen-Profile erstellt. Im Gegensatz zu den Proben normometaboler Hamster, bei denen die Ribosomen vorwiegend in Form von Polysomen vorlagen, konnte bei den Proben torpider Hamster ein Zerfall von Polysomen beobachtet werden. Die Disaggregation von Polysomen lieferte einen Hinweis auf eine reduzierte Proteinsynthese während des Torpors. Bei Transkription und Translation handelt es sich um energieaufwendige Prozesse, die zusammen über 30% der in Form von ATP fixierten Energie beanspruchen. In der Leber, die für ~20% der Basalstoffwechselrate verantwortlich ist, konnte nachgewiesen werden, dass die Inhibition der Synthese von RNA und Protein einen wesentlichen Mechanismus der Stoffwechseldepression beim Eintritt in den täglichen Torpor darstellt. Mittels Northernblot-Analysen wurde die mRNA-Expression von drei Isoenzymen der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase (PDK 1, 2 und 4) im Herzmuskel normometaboler und torpider Hamster untersucht. Die Kinasen inaktivieren durch Phosphorylierung den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDC), was zur Umschaltung von Glucose-Verwertung auf Fettsäuren als primäres Substrat zur Energiegewinnung führt. In einer früheren Studie konnte beim Dsungarischen Zwerghamster eine positive Korrelation zwischen der Stoffwechselrate der Tiere und der Aktivität des PDC u.a. im Herzmuskel festgestellt werden, was auf eine Inaktivierung des Multienzymkomplexes während des täglichen Torpors schließen lässt. Für PDK4 konnte eine leichte Erhöhung der mRNA-Konzentration im Herzmuskel torpider Hamster im Vergleich zu normometabolen Kontrollen festgestellt werden, die jedoch nicht in einer Erhöhung des PDK4-Proteingehalts resultierte. 48-stündiger Futterentzug hingegen hatte eine drastische Erhöhung der PDK4-mRNA-Konzentration zur Folge. Die in früheren Studien an Winterschläfern beobachtete Erhöhung der PDK4-Expression im Herzmuskel könnte eine Anpassung an das chronische Fasten während des Winterschlafs darstellen. Im Gegensatz dazu kommt es während des täglichen Torpors bei Dsungarischen Zwerghamstern nicht zu langfristigem Futterentzug. Sie sind auch im Winter auf eine regelmäßige Nahrungszufuhr angewiesen. Die kurzfristige Regulation der PDKs könnte auf allosterische Effektoren zurückzuführen sein. Als nicht-hypothesenbasierende Ansätze zur Identifikation von im Herzmuskel differentiell exprimierten Genen während des Torpors wurden zwei alternative Methoden verwendet. Bei der cDNA-RDA basierte die Differenzanalyse auf einer subtraktiven Hybridisierung und anschließender selektiver Amplifikation von cDNA-Fragmenten. Alternativ zur cDNA-RDA wurden Maus-Filterarrays zur Identifikation von Unterschieden in der Genexpression eingesetzt. Bei keinem der selektierten Kandidaten konnte die differentielle Genexpression auf Northernblots bestätigt werden. Eine metabolische Reorganisation auf der Grundlage differentieller Genexpression scheint im Herzmuskel nicht zu den zentralen Mechanismen der metabolischen Depression beim Einritt in den täglichen Torpor zu zählen

Seasonal Control of Mammalian Energy Balance : Recent advances in the understanding of daily torpor and hibernation

Funding This work was supported in part by BBSRC grant (BB/M001504/1) to PB, DFG Emmy-Noether HE6383 to AH, German Center for Diabetes Research (DZD) to MJ.Peer reviewedPostprin

Seasonal Control of Mammalian Energy Balance : Recent advances in the understanding of daily torpor and hibernation

Funding This work was supported in part by BBSRC grant (BB/M001504/1) to PB, DFG Emmy-Noether HE6383 to AH, German Center for Diabetes Research (DZD) to MJ.Peer reviewedPostprin

CB1 Signaling in Forebrain and Sympathetic Neurons Is a Key Determinant of Endocannabinoid Actions on Energy Balance

SummaryThe endocannabinoid system (ECS) plays a critical role in obesity development. The pharmacological blockade of cannabinoid receptor type 1 (CB1) has been shown to reduce body weight and to alleviate obesity-related metabolic disorders. An unsolved question is at which anatomical level CB1 modulates energy balance and the mechanisms involved in its action. Here, we demonstrate that CB1 receptors expressed in forebrain and sympathetic neurons play a key role in the pathophysiological development of diet-induced obesity. Conditional mutant mice lacking CB1 expression in neurons known to control energy balance, but not in nonneuronal peripheral organs, displayed a lean phenotype and resistance to diet-induced obesity. This phenotype results from an increase in lipid oxidation and thermogenesis as a consequence of an enhanced sympathetic tone and a decrease in energy absorption. In conclusion, CB1 signaling in the forebrain and sympathetic neurons is a key determinant of the ECS control of energy balance

Bedeutung der EP-Rezeptoren in der Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms/Hyperprostaglandin-E-Syndroms und ihre Funktion in der renalen Elektrolytregulation

Das aBS/HPS ist eine angeborene, autosomal-rezessiv vererbte Salzverlust-Tubulopathie, die zu schweren Entgleisungen des Wasser- und Elektrolythaushaltes führt und unbehandelt tödlich verläuft. Systemisch kommt es unter anderem zu einer exzessiv gesteigerten PGE2-Synthese. Diese stellt eine Schlüsselfunktion in der schweren Pathogenese dieser Erkrankung, mit lebensbedrohlichen Elektrolyt- und Flüssigkeitsverlusten, Dystrophie, Krämpfen, Fieber, Erbrechen und Diarrhö, dar. Die jetzige Standardtherapie blockiert die Prostaglandinsynthese mit Hilfe von Indomethacin, einem nichtselektiven COX-Hemmer, und ist von einer Vielzahl von Nebenwirkungen begleitet. Prostaglandine wirken über spezifische Rezeptoren und erfüllen wichtige regulatorische Aufgaben für die Nierenfunktion. Außerdem sind sie unter anderem an der Regulation der Reninausschüttung beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es die Funktion der Prostaglandinrezeptoren in der renalen Elektrolytregulation und ihre Rolle in der schweren Pathogenese des aBS/HPS genauer zu untersuchen und damit neue spezifischere Ansätze in der Therapie des aBS/HPS aufzudecken. Um diesen Fragestellungen nachzukommen, wurden Mäuse unter Furosemid-, Niedrigsalz- und Hochsalzdiätgabe untersucht. Die Furosemidbehandlung simulierte den schweren Krankheitsverlauf des aBS/HPS, während unter der Diätengabe die Regelmechanismen unter weniger massiven Veränderungen im Salzhaushalt untersucht werden konnten. Analysiert wurden unter anderem die unterschiedlichen Auswirkungen auf die Prostaglandinsynthese, die Reninausschüttung, die Diurese und den Elektrolythaushalt der Tiere. Die Furosemidbehandlung bewirkte beim EP4-Rezeptorknockout-Typ die geringsten Elektrolyt- und Flüssigkeitsverluste im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen. Die Beobachtung, dass durch die Gabe des EP4-Rezeptorantagonisten ONO AE3-208 die Furosemid-stimulierten Wasser- und Elektrolytverluste in gleichem Maße wie beim EP4-Rezeptorknockout-Tier vermindert werden konnten, unterstreicht die These einer Beteiligung des EP4-Rezeptors in der Pathogenese dieser Erkrankung. Eine selektive Hemmung des EP4-Rezeptors könnte daher eine geeignete Therapieform beim aBS/HPS, alternativ zu der heute angewandten Standardtherapie, darstellen. Die starke Diurese und Natriurese beim aBS/HPS kann möglicherweise über die Wirkung von PGE2 auf die Gefäße der Vasa recta erklärt werden. PGE2 ist in der Lage über eine Dilatation der Vasa recta eine erhöhte Markdurchblutung zu bewirken und somit die für die Harnkonzentrierung nötige Osmolarität des Nierenmarks zu erniedrigen (Druckdiurese). Eine vermehrte Diurese und Natriurese ist die Folge. Eventuell ist diese Wirkung auf eine EP4-Rezeptoraktivierung zurückzuführen und könnte damit eine Erklärung für die beim aBS/HPS ausgelösten massiven Salz- und Flüssigkeitsverluste sein. Eine Hemmung des EP1- oder EP3-Rezeptorstyps würde also auch beim aBS/HPS vermutlich keine der EP4-Rezeptor-Hemmung vergleichbare Wirkung erzielen. Der gleichzeitige Defekt des EP1- und EP3-Rezeptors bewirkte im Mausmodell sogar eine beträchtliche Erhöhung der Flüssigkeits- und Elektrolytverluste. Wesentliches Ziel für die Zukunft wäre, eine gezielte Behandlung des aBS/HPS mit selektiven Prostaglandinrezeptor-Inhibitoren zu ermöglichen. Eine selektive Hemmung nur eines oder einzelner Rezeptoren könnte im Hinblick auf die zahlreichen Nebenwirkungen der jetzigen Behandlung eine Verbesserung der Therapiemöglichkeiten bedeuten. Weitere Versuche wären jedoch nötig um die Eignung dieser Therapieform zu belegen und im Hinblick auf Nebenwirkungen zu testen. Weiterführende Analysen können ferner Aufschluss darüber erbringen, ob nicht auch selektive Rezeptorantagonisten und -agonisten wirksame, alternative Medikamente zur Diuresestimulierung oder -verminderung darstellen könnten. Aus den Furosemidversuchen ergeben sich darüber hinaus wichtige Aussagen zur Regulation der Reninfreisetzung. Die verminderte Zunahme der Plasma-Reninkonzentrationen und ein geringerer Anstieg der Renin mRNA-Expression bei EP4-/--und IP-/--Tieren weisen auf eine wesentliche Beteiligung des EP4- und des IP-Rezeptors bei der Reninsekretion hin. In der EP3-/--Gruppe verursachte die Furosemidbehandlung hingegen eine verstärkte Expression der Renin mRNA-Expression. Der EP3-Rezeptor könnte demnach einen hemmenden Einfluss auf die Renin mRNA-Expression nehmen, um möglicherweise ein Überschießen der PGE2-Wirkung zu verhindern. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die beim aBS/HPS ausgelöste starke Hyperreninämie und Diurese offensichtlich vorwiegend auf die Aktivität des EP4-Rezeptors zurückzuführen ist, während der EP4-, aber auch der IP- und der EP2-Rezeptor regulatorische Funktionen für die Reninfreisetzung unter moderater Salzarmut erfüllen

Regulation des Energiehaushalts von Kleinsäugern unter besonderer Berücksichtigung saisonaler Stoffwechseladaptionen des Dsungarischen Zwerghamsters, Phodopus sungorus.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation und Anpassungsfähigkeit des Energiehaushalts von Kleinsäugern und veranschaulicht, wie komplex und vielfältig die regulatorischen Instanzen für einen den Umständen angemessenen Energiestoffwechsel von Endothermen sind. Sie zeigten sich in dieser Arbeit auf Ebene der - Genexpression in der Peripherie, anhand der saisonalen Regulation der Myostatin-Expression. Hier dient sie der Regulation der Organgröße über die Inhibition des Muskelwachstums zugunsten eines geringen Körpergewichtes in jahreszeitlich bedingten Energieversorgungsengpässen im Winter. - posttranslationalen Prozessierung von Neuropeptiden im Zentralnervensystem. So ist die Genexpression und Proteinbiosynthese der an der posttranslationalen Prozessierung des Neuropeptidvorläufers POMC beteiligten PC2 im Kurztag zugunsten appetitsenkender Wirkung hochreguliert, was mit einem gesteigerten Vorkommen der anorexigenen POMC-Spaltprodukte α-MSH und β-Endorphin einhergeht. - endokrinen Kontrolle über die Art der Substratverstoffwechselung, in der offensichtlich das endogen vorkommende Schilddrüsenhormonderivat Thyronamin eine Rolle übernimmt, da es hemmend auf den Glukosestoffwechsel wirkt und zu einer Umstellung auf Lipidstoffwechsel führt. - Signaltransduktion des autonomen Nervensystems. So sind die parasympathischen und sympathischen Aktivitäten an der Generierung ultradianer Rhythmen beteiligt, die eine flexible und schnell reaktionsfähige Regulation physiologischer Prozesse ermöglichen. Desweiteren zeigte sich, daß eine intakte Neurotransmission des Sympathikus für das Auftreten der natürlichen Stoffwechseldepression des täglichen Torpors benötigt wird. - Signaltransduktion in spezialisierten Zentren des ZNS. So führt das Fehlen der zentralen CB1 Rezeptoren des Endocannabinoidsystems zu einer sympathisch vermittelten Reduktion der metabolisierten Energie, einer Steigerung der Lipidoxidation und einer gesteigerten Thermogenese, was in einem niedrigen Körpergewicht und einer Resistenz gegenüber diätinduzierter Adipositas resultiert

Regulationsmechanismen während des Torpors und der zitterfreien Thermogenese: Neue Einblicke und der Einsatz von Magnetresonanztomographie

Säugetiere bevölkern nahezu jede Nische der Erde, weil sie ihre Körpertemperatur unabhängig von der Umgebungstemperatur regulieren können. Diese endotherme Lebensweise ist, besonders für Kleinsäuger, energetisch sehr kostspielig und lässt sich nur durch eine präzise Regulation der Energieausgaben verwirklichen. Regulationsmechanismen, die einer Absenkung des Stoffwechsels, um Energie zu sparen oder einer Stoffwechselsteigerung, um die Körpertemperatur bei Kälteexposition zu verteidigen, zugrunde liegen, sind komplex und in weiten Teilen unverstanden. Messungen von Sauerstoffverbrauch und Körpertemperatur der arid lebenden Goldstachelmaus (Acomys russatus) ergaben, dass A. russatus eine 50%ige Futterreduktion bei hohen Umgebungstemperaturen (32°C und 35°C) energetisch kompensieren kann. Durch eine Reduktion ihres Ruhestoffwechsels um 30% im Vergleich zu ad libitum Bedingungen und täglich mehrstündige torpide Phasen, hielt sie ihr Körpergewicht trotz der verringerten Energiezufuhr nahezu konstant. Im Gegensatz zu Torpor bei Umgebungstemperaturen von 23°C und 27°C, blieb die Körpertemperatur dabei auf einem normothermen Level. Die rapide Absenkung des Metabolismus, ein Charakteristikum von Torpor, kann demnach entkoppelt von einer hypothermen Körpertemperatur stattfinden und ist somit entgegen der landläufigen Meinung nicht nur in kalten, sondern auch in anderen klimatischen Bedingungen eine effiziente Strategie der Energieeinsparung. Als Auslöser für die regulierte Stoffwechselabsenkung im Torpor stehen die Mitochondrien in der Diskussion. Ein aktives Abschalten der Zellatmung könnte zu einer Stoffwechseldepression führen, wie sie bei Eintritt in den Torpor auftritt. Untersuchungen verschiedener Gewebe (z.B. Leber) von torpiden Stachelmäusen ergaben jedoch keine Verringerung der mitochondrialen Succinat-Respiration im Vergleich zu normometabolen Tieren. Auch das Membranpotential der isolierten Mitochondrien und die Effizienz der ATP-Synthase unterschieden sich nicht. Dies galt für torpide Stachelmäuse mit normothermer als auch hypothermer Körpertemperatur. Es weist darauf hin, dass die Absenkung der Stoffwechselrate im Torpor bei A. russatus nicht durch eine Inhibition der Zellatmung induziert wird. Winterakklimatisierte Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) dagegen zeigten im Torpor eine aktive Inhibition der Substratoxidation in den Lebermitochondrien. Die Atmungsraten der Mitochondrien korrelierten mit der Körpertemperatur der Hamster, die bei Umgebungstemperaturen von 15°C sehr tiefe Werte erreichte. Diese Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass eine aktive Inhibition der mitochondrialen Respiration artspezifisch ist und eher eine Anpassung an niedrige Körpertemperaturen im torpiden Zustand als die Ursache des Torporeintritts an sich. Die Mechanismen, die zum Eintritt in den Torpor führen, bleiben somit unklar. Um neue Wege für die Entschlüsselung der Regulationsmechanismen im Torpor zu eröffnen, wurde im nächsten Schritt ein kombinierter Messaufbau aus indirekter Kalorimetrie und Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt, der erlaubte torpide Zwerghamster bildgebend zu untersuchen. Die notwendige Hardware und Software wurde soweit optimiert, dass P. sungorus in einem 7 Tesla-Tomographen torpid wurde und erstmalig morphologische, angiographische und spektroskopische Aufnahmen an einem nicht-narkotisierten Tier im Torpor akquiriert werden konnten. Solch funktionelle Messungen mittels MRT bieten das Potential, neue Einblicke in die Abläufe des Torpors zu gewinnen. Eine weitere Stärke der MRT ist ihr hervorragender Weichgewebekontrast, der es zuließ Gewebe von narkotisierten Tieren in vivo zu untersuchen. Selbst Unterschiede zwischen dem weißen Speicherfett und dem thermogenetisch aktiven braunem Fett ließen sich darstellen und mit gaschromatischen Messungen ex vivo validieren. Weißes Fettgewebe wies einen höheren Gehalt an ungesättigten Fettsäuren auf als braunes Fettgewebe. In der Winteranpassung nahm der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren in beiden Geweben bei P. sungorus zu. Daraus lässt sich eine bedeutsame Funktion der Fettsäuren für die Vorbereitung auf Torpor und kalte Umgebungstemperaturen ableiten. Im letzten Teil der Arbeit wurde die thermogenetische Funktion des braunen Fettgewebes tiefergehend untersucht. Braunes Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle um den Körper aus hypothermen Phasen des Torpors wieder aufzuheizen und um eine normotherme Körpertemperatur bei Kälteexposition zu verteidigen. Hierfür generiert braunes Fett nach noradrenerger Stimulation mittels eines spezifischen Entkopplerproteins (UCP1) zitterfreie Wärme, indem die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien von der Atmungskette entkoppelt wird. Bei langanhaltender Kälteexposition steigt die Fähigkeit zur zitterfreien Thermogeneses durch Erhöhung der respiratorischen Kapazität des Gewebes, und diese wird hauptsächlich auf UCP1-vermittelte Thermogenese zurückgeführt. Knockout-Mäuse, die kein UCP1 besitzen, zeigten dennoch eine Steigerung der zitterfreien Wärmebildung, was auf eine Kompensation der UCP1-vermittelten Thermogenese hinweist. Spektroskopische und bildgebende MRT-Messungen konnten bei UCP1-KO Mäusen wie bei Wildtypmäusen eine Umstrukturierung des braunen Fettgewebes bei Kälteanpassung visualisieren. Nach noradrenerger Stimulation konnte eine Erhöhung des Lipidmetabolismus nachgewiesen werden. Der gesteigerte Lipidstoffwechsel führte bei beiden Genotypen zu einem immensen Export von Fettsäuren, dem wichtigsten Substrat der Thermogenese, aus dem braunen Fettgewebe. Die Daten sprechen für einen UCP1-unabhängigen Mechanismus zur adaptiven Thermogenese und eine wichtige Funktion des braunen Fettgewebes im Lipidstoffwechsel, die über die Oxidation von Fettsäuren für die UCP1-vermittelte Thermogenese hinausgeht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen zu einem weiterführenden Verständnis der Regulationen des Energiehaushalts kleiner Säugetiere bei. Sie decken Zusammenhänge zwischen der aktiven Stoffwechselabsenkung, der Körpertemperatur, der Umgebungstemperatur und der mitochondrialen Respirationsleistung auf. Sie beleuchten den Einsatz der MRT als innovative Methode für die Untersuchung physiologischer Fragestellungen und werfen ein neues Licht auf die Funktion des braunen Fettgewebes bei der UCP1-unabhängigen zitterfreien Thermogenese