Stakeholder Engagement als Optimierungsmöglichkeit klinischer Studien

Background: Stakeholder engagement stands for the active involvement of diverse concerned groups in research. It is expected to increase the relevance of research questions and outcomes and facilitate transparency and recruitment. The topic of engaging multiple actors in clinical research is rapidly gaining attention. The use of stakeholder engagement by researchers in Germany is unknown. We investigated the current practice of stakeholder engagement in clinical research in DACH countries (Germany, Austria, and Switzerland), as well as North America and China. We aimed to evaluate researchers’ experience with stakeholder engagement and their percep-tion of this method for future research. Methods: We conducted a cross-sectional study using an international online survey. Researchers completed questions covering sociodemographic information, professional experience, and details about stakeholder engagement in clinical research, such as former practice, future predictions, challenges, and potential. Data were analyzed descriptively. Additionally, we tested for differences among means and controlled for a covariate. Results: We received 245 filled questionnaires and grouped the participants by the three predetermined world regions. Out of all participants, 11.02 % (27/245) named North America, 22.45 % (55/245) DACH, and 51.84 % (127/245) China as their country of residence. We excluded participants who marked another or ‘none’ as state of residence (14.69 %, 36/245) from the statistical analyses. Researchers from North America agreed on a scale from 0 to 10 with 8.41 ± 2.3 points (mean ± sd) about the essentiality of stakeholder engagement in clinical research. Participants from China rated similar (8.12 ± 2.1) and those from DACH significantly lower (4.23 ± 2.9, p < 0.001). Amongst other aspects, the opinion about stakeholder engagement increasing the relevance of research questions and outcomes differed significantly between regions (DACH: 6.95 ± 2.8, North America: 8.05 ± 2.3, China: 8.37 ± 1.8, p = 0.009). The use of digital methods in stakeholder engagement was rated lowest by DACH re-spondents, e.g., Smartphone Application, with a mean of 5.04 ± 2.4 (North America: 6.59 ± 1.9, China 8.28 ± 2.5, p < 0.001). Conclusion: We found a heterogeneous perception of stakeholder engagement among researchers from the three different world regions. To improve the knowledge and possibility of implementing stakeholder engagement, we recommend increased international exchange and specific training for researchers in DACH.Hintergrund: Stakeholder Engagement steht für die aktive Einbeziehung verschiedener betroffener Gruppen in die Forschung. Diese Methode kann die Relevanz von Forschungsfragen und -ergebnissen erhöhen und die Transparenz und Rekrutierung in einer Studie erleichtern. Das Thema der Einbindung verschiedener Akteure in der klinischen Forschung gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Die aktuelle Praxis der Einbeziehung von Interessengruppen durch Forschende in Deutschland ist jedoch unbekannt. In dieser Studie untersuchten wir die Einbeziehung von Stakeholdern in der klinischen Forschung in DACH Ländern (Deutschland, Österreich, Schweiz), sowie in Nordamerika und China. Unser Ziel war es, die Erfahrungen von Forschenden mit der Einbeziehung von Stakeholdern und ihre Wahrnehmung dieser Methode für die zukünftige Forschung zu bewerten. Methoden: Wir führten eine Querschnittsstudie mittels einer internationalen Online-Umfrage durch. Die von den Forschenden ausgefüllten Fragenkomplexe umfassten soziodemographische Daten sowie zukünftige Prognosen, Herausforderungen und Potenziale der Einbindung von Stakeholdern in die klinische Forschung. Die Daten wurden deskriptiv ausgewertet. Zusätzlich testeten wir auf Unterschiede zwischen den Mittelwerten und kontrollierten für eine Kovariate. Ergebnisse: Wir erhielten 245 ausgefüllte Fragebögen und gruppierten die Teilnehmenden nach den drei zuvor festgelegten Weltregionen. Von allen Teilnehmenden gaben 11,02 % (27/245) Nordamerika, 22,45 % (55/245) DACH und 51,84 % (127/245) China als Wohnort an. Teilnehmende, die ein „anderes“ oder „kein“ Land als Wohnsitz angaben (14,69 %, 36/245) wurden von den statistischen Analysen ausgeschlossen. Forschende aus Nordamerika stimmten auf einer Skala von 0 bis 10 mit 8,41 ± 2,3 Punkten (Mittelwert ± sd) überein, dass die Einbindung von Stakeholdern in der klinischen Forschung essentiell ist. Teilnehmende aus China bewerteten dies ähnlich (8,12 ± 2,1), Teilnehmende aus DACH mit deutlich niedrigeren Werten (4,23 ± 2,9, p < 0,001). Unter anderem unterschieden sich die Meinungen darüber, ob die Einbeziehung von Interessengruppen die Relevanz von Forschungsfragen und -ergebnissen erhöht, in den Weltregionen signifikant (DACH: 6,95 ± 2,8, Nordamerika: 8,05 ± 2,3, China: 8,37 ± 1,8, p = 0,009). Der Einsatz digitaler Methoden bei der Einbindung von Stakeholdern wurde von Teilnehmenden aus DACH am niedrigsten bewertet, z.B. Smartphone Applikation mit einem Mittelwert von 5.04 ± 2.4 (Nordamerika: 6.59 ± 1.9, China 8.28 ± 2.5, p < 0.001). Schlussfolgerung: Wir stellten fest, dass Forschende aus verschiedenen Weltregionen die Einbeziehung von Stakeholdern sehr unterschiedlich beurteilen. Um das Wissen und die Möglichkeiten zur Umsetzung von Stakeholder Engagement zu verbessern, empfehlen wir einen verstärkten internationalen Austausch und spezifische Schulungen für Forschende in DACH

NAIL-MS Untersuchungen von RNA-Modifikationen in eukaryotischen Modellorganismen

In vielen Bereichen der Wissenschaft gewinnt die Dynamik der RNA-Modifikationen zu-nehmend an Bedeutung. So häufen sich die Nachweise von Korrelationen zwischen be-stimmten RNA-Modifikationen und Krankheitsbildern wie Krebs oder neurologischen Stö-rungen. Mutationen im Enzym TRMT1 und eine damit einhergehende Änderung der m22G-Abundanz wurde beispielsweise mit der neurologischen Erkrankung amyotrophe Late-ralsklerose (ALS) in Verbindung gebracht. Ein besseres allgemeines Verständnis der RNA-Modifikationsdynamik ist daher essenziell. Gerade die molekularen Ursachen und Funktio-nen der Biosynthese sowie der Reifung und des Abbaus von RNA-Molekülen erfordern ein-gehendere Untersuchungen. Massenspektrometrische Analysen tragen dabei maßgeblich zur Untersuchung der molekula-ren Ursachen und Auswirkungen von RNA-Modifikationen bei. Eine Einschränkung dabei ist allerdings, dass größtenteils statische Level analysiert werden und der Aspekt der Modi-fikationsdynamik somit meist vernachlässigt wird. Eine Technik, welche imstande ist, eini-ge der Schwächen von Massenspektrometrie zu kompensieren, ist NAIL-MS (Nucleic Acid Isotope Labeling coupled Mass Spectrometry). Am erfolgversprechendsten ist die mögliche Durchführung von „Pulse-Chase“-Experimenten zur simultanen Analyse bereits existieren-der und neu transkribierter RNA-Moleküle. Das primäre Ziel im Zuge meiner Arbeit bestand daher in der Etablierung und Anwendung von NAIL-MS in Zellkulturen. Die gewünschte Isotopenmarkierung wurde über die Supplementierung von isotopenmarkierten Varianten der Nukleobase Adenin und des Nukleosids Uridin erreicht. Zudem wurde zur Verfolgung von Modifizierungsprozessen dem Zellkulturmedium D3 Methionin zugegeben, welches als Methylgruppen-Donor dient. Durch die anschließende Anwendung von NAIL-MS war es mir beispielsweise möglich auf-zuzeigen, dass das Molekül Rhein vermutlich nicht – wie kürzlich in der Literatur beschrie-ben – eine spezifische Inhibition des Enzyms ALKBH3 hervorruft. ALKBH3 soll für die Demethylierung von m1A und m3C in tRNA-Molekülen verantwortlich sein. Weder über unmarkierte LC-MS/MS-Analytik noch über NAIL-MS-Untersuchungen konnte ich diese Behauptung jedoch bestätigen. Stattdessen konnte über NAIL-MS ein Effekt von Rhein auf die Transkriptionsrate von tRNA-Molekülen festgestellt werden, wodurch die beobachtete Änderung des Modifikationsprofils hervorgerufen werden. Aufgrund dieser Anpassung ent-stand vermutlich die Fehlinterpretation, Rhein sei für die spezifische Inhibition von ALKBH3 geeignet. Die in der Literatur beobachteten Effekte können aufgrund der über NAIL-MS erhobenen Daten demnach aber vielmehr auf allgemeine Adaptionsmechanismen der Zellen zurückgeführt werden. Ebenso gelang es mir, den Effekt des methylierenden Agens Methylmethansulfonat (MMS) auf DNA und RNA näher zu beleuchten. Während MMS in der Wissenschaft oft als Methyl-ierungsagens von DNA-Molekülen verwendet wird, ist eine Methylierung von RNA kaum beschrieben. Über unmarkierte LC-MS/MS-Analytik konnte auch ich ausschließlich Schä-den in DNA, aber nicht in RNA detektieren. Durch die Anwendung von NAIL-MS konnte ich jedoch zeigen, dass in RNA MMS-induzierte Methylierungen vergleichbaren Ausmaßes stattfinden. Besonders ausgeprägt ist dies für m7G in rRNA; entsprechende Schäden in tRNA werden von der Zelle nahezu vollständig ignoriert. Eine Detektion dieser gelang durch un-markierte LC-MS/MS-Analytik nicht, da die Menge an Modifikationen in RNA allgemein sehr hoch ist, und somit die vergleichsweise geringen Signale der induzierten Schäden über-lagert wurden. Die mitunter wohl größte Stärke von NAIL-MS ist die Möglichkeit „Pulse-Chase“-Experimente durchzuführen, um einen genaueren Einblick in die RNA-Modifikationsdynamiken zu gewinnen. NAIL-MS ermöglichte mir somit eine genauere Un-tersuchung des Reifungsprozesses verschiedener RNA-Moleküle. Gängige LC-MS/MS-Analytik kann dadurch um eine Dimension, nämlich Zeit, erweitert werden. So konnte ich zeigen, dass beim Einbau von Modifikationen in tRNAPhe eine sequenzielle Ordnung zu be-stehen scheint. Während bestimmte Modifikationen in der D-Schleife und der TΨC-Schleife vergleichsweise schnell inkorporiert werden, können hohe Mengen der in der Anticodon-Schleife lokalisierten Modifikationen erst später nachgewiesen werden. Eine Hierarchie im Einbau von Modifikationen wurde ebenso über zeitaufgelöste NMR-Experimente nachge-wiesen. Besonders interessant erscheint außerdem die Dynamik von m5U in den meisten tRNA-Isoakzeptoren, speziell aber in tRNAAsn. Die Menge an m5U ist zu Beginn des Lebens-zyklus von tRNA-Molekülen stets höher als erwartet und nimmt erst im Laufe der Reifung ab. Dies deutet auf eine bisher nicht beschriebene aktive Demodifizierung einer m5U-Position hin und könnte als Teil der Reifung von tRNA-Molekülen essenziell sein. Einen besonderen Fokus legte ich auf den molekularen Einfluss der Modifikation Queuosin (Q) und dessen Zucker-Derivate. Der Einbau dieser Modifikationen ist von der, in den zuge-gebenen Nährstoffen enthaltenen Nukleobase Queuin abhängig. Für eine volle Modifizie-rung der Q-Modifikationen in den entsprechenden tRNA-Isoakzeptoren ist eine zusätzliche Supplementierung von Queuin nötig. Über NAIL-MS wurden zahlreiche Effekte dieser Supplementierung auf andere Modifikationen erfasst. Wie bereits zuvor berichtet, wurde eine Abhängigkeit zwischen m5C38 und ManQ34 in tRNAAsp beobachtet. In der hier vorge-legten Arbeit konnte ich näher auf die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen einge-hen. Aufgrund der erhobenen Daten wird ein vergleichbarer Effekt für m1Ψ39 in tRNATyr postuliert. Im selben tRNA-Isoakzeptor wurde bei Fehlen von Queuin für die Modifikation m22G eine erhöhte Einbaueffizienz festgestellt. Besonders stark ausgeprägt ist zudem der 20-fache Anstieg von Gm im Vergleich zur ursprünglichen Menge. In An- bzw. Abwesenheit von Queuin scheint die Reifung von tRNA-Molekülen somit stark verändert zu sein. Alle beobachteten Effekte deuten auf eine Abhängigkeit zwischen den einzelnen Modifikationen hin. RNA-Modifikationen, insbesondere in tRNA-Molekülen, sollten daher nicht isoliert, sondern immer in ihrem Netzwerk betrachtet werden. Besonders bei der Untersuchung der Effekte von RNA-Modifikationen und deren Dynamik hinsichtlich der berichteten Krank-heitsmodelle sollte dies beachtet werden. Zusammenfassend konnte ich durch die Anwendung von NAIL-MS zahlreiche bemerkens-werte Mechanismen der Modifikationsdynamik und Unterschiede im Modifikationsprofil beobachten, welche ohne die Anwendung von NAIL-MS größtenteils nicht analysierbar ge-wesen wären. Der Erkenntnisgewinn bezüglich der untersuchten Mechanismen könnte hin-sichtlich des steigenden Interesses an RNA-Modifikationen und deren weitreichenden Ein-flüsse in der Zelle für klinische Zwecke von hoher Relevanz sein.In many areas of science, the dynamics of RNA modifications are becoming increasingly important. There is more and more evidence of correlations between certain RNA modifica-tions and diseases such as cancer or neurological disorders. For example, mutations in the TRMT1 enzyme and an associated change in the amount of m22G modification have been linked to the neurological disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, a better general understanding of RNA modification dynamics is essential. Especially the molecular causes and functions of biosynthesis, as well as maturation of RNA molecules, but also of their degradation, require more detailed investigations. Mass spectrometric analyses contribute significantly to the investigation of the molecular causes and effects of RNA modifications. A limitation is, however, that mostly static levels are analyzed, and the aspect of modification dynamics is thus mostly neglected. One tech-nique that is able to compensate for some of the weaknesses of mass spectrometry is NAIL-MS (Nucleic Acid Isotope Labeling coupled Mass Spectrometry). Most promising is the possible performance of Pulse-Chase experiments for simultaneous analysis of pre-existing and newly transcribed RNA molecules. The primary goal of my work was therefore to estab-lish and apply NAIL-MS in cell cultures. The desired isotopic labeling was achieved by sup-plementing isotopically labeled variants of adenine (nucleobase) and uridine (nucleoside). To follow modification processes, D3-methionine was added to the cell culture medium, which serves as a methyl group donor of the methylated modifications. Subsequent application of NAIL-MS allowed me to demonstrate that the small molecule Rhein probably does not cause specific inhibition of the enzyme ALKBH3, as recently de-scribed in literature. ALKBH3 is thought to be responsible for the demethylation of m1A and m3C in tRNA molecules. However, neither via unlabeled LC-MS/MS analysis nor via NAIL-MS studies could I confirm this hypothesis. Instead, NAIL-MS revealed an effect of Rhein on the transcription rate of tRNA molecules, causing the observed change in the modifica-tion profile. This adaptation probably led to the misinterpretation of Rhein being suitable for the specific inhibition of ALKBH3. However, based on the NAIL-MS data, effects observed in literature can rather be attributed to general adaptation mechanisms of the cells. I also succeeded in shedding more light on the effect of the methylating agent methyl me-thanesulfonate (MMS) on DNA and RNA. While MMS is often used in science as a methyl-ating agent of DNA molecules, methylation of RNA has hardly been described. Using unla-beled LC MS/MS analysis, I also could only detect damage in DNA but not in RNA. By us-ing NAIL-MS, however, I was able to show that damage of comparable dimension occurs in RNA molecules. These could not be detected by unlabeled LC-MS/MS analysis, due to the generally very high levels of modifications in RNA molecules. Especially rRNA seems to be affected, whereas damage in tRNA is almost completely ignored by the cell. Probably one of the greatest strengths of NAIL-MS is the ability to perform Pulse-Chase experiments to gain a more detailed insight into RNA modification dynamics. NAIL-MS thus allowed me to examine the maturation process of various RNA molecules in more de-tail. Common LC-MS/MS techniques can thus be extended by the dimension "time". Thus, I could show that there seems to be a sequential order in the incorporation of modifications into tRNAPhe. While certain modifications in the D-loop and the TΨC-loop are incorporated comparatively quickly, high amounts of modifications localized in the anticodon loop can only be detected later. A hierarchy in the incorporation of modifications was also demon-strated by time-resolved NMR experiments. Furthermore, the dynamics of m5U in most tRNA isoacceptors, but especially in tRNAAsn, appears to be particularly interesting. The amount of m5U is always higher than expected at the beginning of the life cycle of tRNA molecules and only decreases during maturation. This suggests a previously undescribed active demodification of an m5U position and could be essential as part of the maturation of tRNA molecules. I placed a particular focus on the molecular impact of the queuosine modifications. The in-corporation of this modification is dependent on the nutrient queuine. For a full modifica-tion of the Q-modifications in the corresponding tRNA isoacceptors, an additional supple-mentation of queuine is necessary. Numerous effects of this supplementation on other modi-fications were detected via NAIL-MS. As previously reported, a dependency between m5C38 and ManQ34 in tRNAAsp was observed. In the work presented here, I was able to elaborate on the underlying molecular mechanisms. Based on the data collected, a comparable effect is postulated for m1Ψ39 in tRNATyr. In the same tRNA isoacceptor, increased incorporation efficiency was observed in the absence of queuine for the m22G modification. Moreover, the 20-fold increase in Gm compared with the original amount is particularly striking. In the presence or absence of queuine, the maturation of tRNA molecules thus appears to be strongly altered. All observed effects indicate a dependence between the individual modifi-cations. RNA modifications, especially in tRNA molecules, should therefore not be consid-ered in isolation but always in their corresponding network. Especially when studying the effects of RNA modifications and their dynamics with respect to reported disease models, this should be kept in mind. In summary, through the application of NAIL-MS, I was able to observe numerous remarka-ble mechanisms of modification dynamics and differences in modification profiles, most of which would not have been analyzable without the application of NAIL-MS. The knowledge of the investigated mechanisms could potentially be of high relevance for clinical purposes due to the increasing interest in RNA modifications and their far-reaching influences in the cell

Basiswissen RDA : eine Einführung für deutschsprachige Anwender / Heidrun Wiesenmüller und Silke Horny

Rezensio

Funktionelle Charakterisierung von TRAP-Invasinen in Plasmodium und Identifizierung eines potentiellen Invasins in Merozoiten

Plasmodium-Parasiten durchlaufen einen komplexen Lebenszyklus in zwei Wirten und müssen jeweils spezifisch verschiedene Zelltypen invadieren. In Sporozoiten und Ookineten konnten Mitglieder der TRAP-Familie als Invasine charakterisiert werden. Im Gegensatz dazu ist das Protein, das den Eintritt der Merozoiten in die Erythrozyten vermittelt, noch nicht bekannt. Die Merozoiten-Invasion verläuft in mehreren Schritten, die aus einer reversiblen Adhäsion, einer Re-Orientierung des apikalen Pols, einer irreversiblen Adhäsion begleitend mit der Ausbildung einer elektronen-dichten Verbindung (tight junction) und dem Eintritt der Parasiten in die Wirtszelle bestehen. Es konnten zwar Proteine des Parasiten identifiziert werden, die bei der Erythrozyten-Invasion beteiligt sind, jedoch ist deren direkte Funktion bei der aktiven Invasion weitgehend ungeklärt. Proteine der TRAP-Familie übertragen eine extrazelluläre Bindung an ein Substrat oder Rezeptor an die Motormaschinerie des Parasiten, wodurch dieser aktiv in die Wirtszelle eindringen kann. Datenbankanalysen zeigten, dass im Genom von P. falciparum ein weiteres Protein zu finden ist, das die charakteristischen, strukturellen Merkmale von Invasinen der TRAP-Familie aufweist. Dieses Protein, TLP1 (TRAP-like protein 1), besitzt extrazellulär zwei von Willebrand A-Domänen die durch einen TSR (thrombospondin typeI repeat) voneinander getrennt werden, eine Transmembrandomäne und eine kurze zytoplasmatische Domäne, die durch eine Ansammlung negativer Aminosäure-Reste und ein konserviertes C-terminales Tryptophan gekennzeichnet ist. TLP1 ist in den Blutstadien exprimiert und ist während des asexuellen Wachstums in späten Schizonten angereichert. Ein charakteristisches Merkmal ist eine stadien-spezifisch essentielle Funktion der TRAP-Proteine. Dies trifft auch für TLP1 zu. Mit Hilfe der reversen Genetik konnte gezeigt werden, dass TLP1 für die Blutstadien-Entwicklung des Parasiten notwendig ist. Die zytoplasmatische Domäne (CTD) von Invasinen der TRAP-Familie wird durch Aldolase-Tetramere mit dem Aktin-Myosin-Motor verbunden. Mit Hilfe von in vitro-Bindungsstudien konnten wir zeigen, dass auch die Carboxy-terminale Domäne von TLP1 mit Aldolase interagiert. Ein wichtiger funktioneller Test für eine direkte Funktion in der Invasion sind in vivo-Komplementations-Studien, in denen gezeigt wird, ob die essentielle Funktion der zytoplasmatischen Domäne von TRAP durch orthologe Regionen von Kandidaten-Proteinen ersetzt werden kann. Die zytoplasmatischen Domänen von TLP1 und von CTRP, dem beschriebenen Ookineten-Invasin, können die TRAP-CTD-Mutante partiell retten. Mit diesem Ansatz konnte desweiteren EBA175, das in der Literatur als TRAP-Paralog in Blutstadien postuliert wurde, ausgeschlossen werden. Zusätzlich konnte MTI-1, ein weiteres in der Datenbank identifiziertes TRAP-ähnliches Protein, durch diese funktionelle Charakterisierung von dieser Invasin-Familie getrennt werden. TLP1 erfüllt somit die Kriterien eines Invasins der TRAP-Familie in Blutstadien. Zusammen mit weiteren Merozoiten-Oberflächenproteinen könnte TLP1 die Translokation der Verbindung zwischen Parasiten- und Wirtszellmembran (tight junction) ausführen und somit die Invasion der Merozoiten in Erythrozyten vermitteln