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Multiphoton and Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Studying Nanoparticle Pharmacokinetics in Skin and Liver
The use of nanoparticles has increased in consumer products in recent decades; however, concerns regarding their safety remain. Zinc oxide is used in sunblocking and may generate free radicals in response to UV illumination, leading to DNA damage and an immunological response. With highâresolution, highâcontrast imaging in biological tissue, multiphoton microscopy is able to separate nanoparticles signals from endogenous fluorophores. It has been proven to be very useful in imaging penetration of zinc oxide nanoparticles in skin and in combination with fluorescence lifetime imaging microscopy study cellular function as well. This chapter aims to review the use of these imaging techniques in studying the uptake and distribution of nanoparticles in skin and liver. Due to the questionable clinical use and possible toxicity of nanoparticles, it is important to study their pharmacokinetics. Some nanomaterials have been identified as relatively toxic to humans and a few metal nanoparticles have been reported to penetrate and be detected in blood. Multiphoton microscopy has high resolution and is able to visualize nanoparticles, due to their optical properties, in vivo. The addition of fluorescence lifetime imaging makes it possible to measure the physiochemical environment, with outputs that can be statistically analyzed, posing an advantage over fluorescence intensity imaging only
New Binding Mode to TNF-Alpha Revealed by Ubiquitin-Based Artificial Binding Protein
A variety of approaches have been employed to generate binding proteins from non-antibody scaffolds. Utilizing a beta-sheet of the human ubiquitin for paratope creation we obtained binding proteins against tumor necrosis factor (TNF)-alpha. The bioactive form of this validated pharmacological target protein is a non-covalently linked homo-trimer. This structural feature leads to the observation of a certain heterogeneity concerning the binding mode of TNF-alpha binding molecules, for instance in terms of monomer/trimer specificity. We analyzed a ubiquitin-based TNF-alpha binder, selected by ribosome display, with a particular focus on its mode of interaction. Using enzyme-linked immunosorbent assays, specific binding to TNF-alpha with nanomolar affinity was observed. In isothermal titration calorimetry we obtained comparable results regarding the affinity and detected an exothermic reaction with one ubiquitin-derived binding molecule binding one TNF-alpha trimer. Using NMR spectroscopy and other analytical methods the 1â¶3 stoichiometry could be confirmed. Detailed binding analysis showed that the interaction is affected by the detergent Tween-20. Previously, this phenomenon was reported only for one other type of alternative scaffold-derived binding proteins â designed ankyrin repeat proteins â without further investigation. As demonstrated by size exclusion chromatography and NMR spectroscopy, the presence of the detergent increases the association rate significantly. Since the special architecture of TNF-alpha is known to be modulated by detergents, the access to the recognized epitope is indicated to be restricted by conformational transitions within the target protein. Our results suggest that the ubiquitin-derived binding protein targets a new epitope on TNF-alpha, which differs from the epitopes recognized by TNF-alpha neutralizing antibodies
Single-Molecule Spectroscopy on Photosystem I
* Titel und Inhaltsverzeichnis
* Einleitung
* Photosystem I
* Optische Spektroskopie an einzelnen MolekĂŒlen
* Experiment
* Spektrale Gliederung der roten Chlorophyll-VerbÀnde
* Energielandschaft der Proteinumgebung
* Charakterisierung der roten ZustÀnde
* Zusammenfassung und Ausblick
* Summary
* Anhang
* LiteraturverzeichnisIm Antennensystem von Photosystem I (PS I) existiert eine kleine Gruppe
Chlorophylle, deren optische Ăbergangsenergien gegenĂŒber der erforderlichen
Anregungsfrequenz des Reaktionszentrums (RC) rotverschoben liegen. Sie werden
daher allgemein als "rote Chlorophylle" bezeichnet. Sie ĂŒbernehmen eine
SchlĂŒsselrolle in der PS I-Forschung. Weder ihre Funktion in der Natur, noch
der Mechanismus, der zu ihrer Rotverschiebung fĂŒhrt, sind endgĂŒltig geklĂ€rt.
Bei kryogener Temperatur stellen die roten Chlorophylle fĂŒr die
Anregungsenergie eine Falle dar, denn zum EnergieĂŒbertrag auf das RC fehlt die
vibronische Energie in der Proteinmatrix, die unter physiologischen
Bedingungen genutzt wird. Die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute
ermöglicht der EinzelmolekĂŒl-Spektroskopie (SMS) den Zugang zum System. Ihr
Vorteil gegenĂŒber konventionellen Spektroskopiemethoden besteht darin, dass
die Mittelung ĂŒber ein Ensemble vermieden wird. Um mit SMS die roten Pigmente
im PS I zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein konfokales
Spektrometer aufgebaut, das die Fluoreszenz einzelner MolekĂŒle bei 1,4 K
messen kann. Als Proben fĂŒr die Ergebnisse in dieser Schrift dienten
cyanobakterielle PS I-Komplexe der Organismen Thermosynechococcus elongatus
(T. elongatus), Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002. In
der Literatur wurden die roten Chlorophylle der PS I von T. elongatus und
Synechocystis mittels GauĂscher Zerlegung der Ensemble-Absorptionsspektren in
Pigment-VerbÀnde unterteilt. Entsprechend den spektralen Positionen der Maxima
bei 708 nm und 719 nm wurden die VerbÀnde im PS I von T. elongatus als C708
und C719 bezeichnet und analog im PS I von Synechocystis als C706/C708 und
C714. Ein Ergebnis dieser Arbeit ist die Bestimmung der Anzahl der roten
Emitter im PS I von T. elongatus. Diese konnte mit Hilfe einer spektral
aufgelösten Polarisationsanalyse der Fluoreszenz von Monomeren auf drei
festgelegt werden. Mindestens einer dieser roten ZustÀnde kann je nach
selektiertem Komplex im Spektralbereich des C708- oder des C719-Verbands
emittieren. Bei den PS I aller drei Spezies wurden im Spektralbereich der
jeweiligen roten Chlorophylle scharfe Null-Phononen-Linien (ZPLs) beobachtet.
Demnach konnten erstmals ZPLs beim PS I von Synechocystis beobachtet werden.
Dadurch wurden die Schlussfolgerungen einer kĂŒrzlich veröffentlichten Arbeit,
in der das Auftreten von ZPLs bestritten wurde, widerlegt. WĂ€hrend die ZPLs
vom PS I von T. elongatus zwei spektral voneinander getrennte BĂ€nder in den
spektralen Regionen der VerbÀnde C708 und C719 bilden, treten die ZPLs vom PS
I von Synechocystis in den Bereichen der VerbÀnde C706/C708 und C714 auf, ohne
klare Separation voneinander. Beim PS I von Synechococcus sp. PCC 7002 liegt
der gröĂte Teil der aufgetretenen ZPLs in einem Band mit mittlerer Lage bei λ
â 698 nm. Der zugehörige Chlorophyll-Verband wurde daher als F698 bezeichnet.
FĂŒr die ZPLs der PS I aller drei Spezies ist eine starke spektrale Diffusion
charakteristisch. Sie wird auf strukturelle Fluktuation in der
Proteinbindungstasche der roten Chlorophylle zurĂŒckgefĂŒhrt, die zu
VerĂ€nderungen in der StĂ€rke der lokalen Wechselwirkungen fĂŒhren und somit zu
Fluktuationen der optischen Ăbergangsenergien. Beim PS I von T. elongatus
wurde festgestellt, dass sich die Korrelation zwischen der Fluktuationsrate
und der spektralen Sprungweite der ZPLs in voneinander separierte Bereiche
aufteilen lÀsst. Dieses Ergebnis passt zum Bild einer in hierarchischen RÀngen
organisierten Energielandschaft, in der die mittlere Barrierenhöhe von oben
nach unten abnimmt. Im Vergleich wurden hingegen beim PS I der Spezies
Synechocystis zunÀchst keine voneinander separierten Bereiche in der
Korrelation zwischen Fluktuationsrate und spektraler Sprungweite der ZPLs
gefunden. Der Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium im Lösungsmittel hat
bei den PS I beider Organismen zu einem signifikanten Deuteriumeffekt gefĂŒhrt.
Er Ă€uĂerte sich in einer Verringerung der spektralen Fluktuationen in der
Fluoreszenz. Das spricht dafĂŒr, dass die PositionsĂ€nderung von Protonen einer
der Hauptprozesse ist, mit denen im PS I die lokalen optischen
Ăbergangsenergien der Pigmente feinabgestimmt werden. Ein interessanter
Bestandteil des Deuteriumeffekts beim PS I von Synechocystis ist die hÀufige
Erzeugung von Bi- bzw. TristabilitÀten. Diese können durch die herabgesetzte
Tunnelwahrscheinlichkeit eines Deuterons im Vergleich zu der eines Protons
erklÀrt werden. Durch einen indirekten Nachweis wurde gezeigt, dass spektrale
SprĂŒnge von ZPLs ĂŒber 10 cm-1 bei 1,4 K erst durch die Einstrahlung von
Energie wahrscheinlich werden. Daher scheinen unter kryogenen Bedingungen
Tunnelprozesse von Protonen in der unmittelbaren Proteinumgebung der roten
Pigmente ohne Ă€uĂere Anregung sehr unwahrscheinlich. Durch den Austausch von
Wasserstoff gegen Deuterium im Lösungsmittel lieà sich interessanterweise beim
PS I von Synechocystis die Korrelation zwischen der Fluktuationsrate und der
spektralen Sprungweite der ZPLs, wie beim PS I von T. elongatus ohne
entsprechenden Austausch, in voneinander separierte Bereiche aufteilen. Ein
Auswerteverfahren zum Ausgleich von spektraler Diffusion wurde dazu genutzt,
um einen groĂen Teil der zeitlichen Mittelung im Fluoreszenzsignal einzelner
PS I-Komplexe zu eliminieren. Dadurch konnten aus den Spektrensequenzen der PS
I aller drei Spezies spektrale Profile von roten ZustÀnden nahe der homogenen
Linienformen exzerpiert werden. Theoretisch lÀsst sich die Linienform eines
Pigments in einem Proteinkomplex durch die Spektraldichte beschreiben. Zur
Simulation der Linienform wurde ein Algorithmus verwendet, der die Pigment-
Protein-Kopplung mit der NĂ€herung, dass die Fluktuation der Ăbergangsenergie
linear von der Auslenkung der Kerne aus ihrer Gleichgewichtslage abhÀngt, und
mit der Annahme einer lorentzförmigen Spektraldichte iterativ berechnet. Bei
den PS I aller drei oben genannten Spezies wurden selbst fĂŒr stark
rotverschobene ZustĂ€nde ĂŒberraschend kleine Huang-Rhys-Faktoren festgestellt,
was bedeutet, dass die elektronischen ĂbergĂ€nge nur schwach an die inter- und
intramolekularen vibronischen Freiheitsgrade koppeln. Dieses Ergebnis
erweitert das Bild der roten ZustĂ€nde auf die Weise, dass fĂŒr ihre starke
Rotverschiebung keine starke Elektron-Phonon-Kopplung notwendig ist. Als
alternative Ursache wurde die Anhebung der exzitonischen Aufspaltung durch
einen hohen Beitrag des Dextermechanismus vorgeschlagen. Um zu untersuchen, ob
verschiedene rote ZustĂ€nde innerhalb eines PS I-Komplexes ĂŒber Energietransfer
(ET) miteinander in Verbindung stehen, wurde das Korrelationsverhalten der
Fluoreszenz von unterschiedlichen roten Emittern analysiert. Mehrfach
aufgetretene Antikorrelationen bei sowohl dem PS I von T. elongatus als auch
dem PS I von Synechocystis weisen darauf hin, dass die roten ZustÀnde jeweils
entweder direkt ĂŒber ET miteinander verbunden sind, oder dass sie getrennt
voneinander ĂŒber ET mit einem Pigment-Verband aus den Antennenpigmenten
verbunden sind. Auch eine Mischung aus beiden Konfigurationen ist denkbar.
Beim PS I von T. elongatus wurde zusÀtzlich mittels einer Polarisationsanalyse
an einzelnen Monomeren festgestellt, dass die Ăbergangsdipolmomente der
Emitter vom C708 und C719 in einem Winkel nahe 90° zueinander stehen. Demnach
wĂŒrde man im Falle eines direkten ETs zwischen den beiden VerbĂ€nden erwarten,
dass bei einer Anregung mit linear polarisiertem Licht mit einer WellenlÀnge
von ~712 nm die Polarisation der Fluoreszenz einen groĂen Anteil enthĂ€lt, der
nicht der Polarisation des eingestrahlten Lichts entspricht. Dieses Verhalten
geht aus einer Anisotropiestudie am Ensemble hervor. Daher wird ein
effizienter direkter ET zwischen ZustÀnden des C708- und C719-Verbands
innerhalb eines Monomers fĂŒr wahrscheinlich gehalten.A confocal spectrometer for low temperatures with sufficient efficiency to
detect single-molecule fluorescence was built in the course of this work. It
was used to investigate spectral properties, heterogeneities and dynamics of
the low-energy antenna chlorophylls in individual Photosystem I (PS I)
complexes from three different cyanobacteria: Thermosynechococcus elongatus
(T. elongatus), Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002. A
fluorescence polarization analysis on single PS I monomers from T. elongatus
reveals three pigment pools contributing to the red-shifted emission. In
addition, the angle between the transition dipole moments of emitters from
C708 and C719 were determined to be near 90°. In the spectral regions of the
red-most states of all three species intense zero-phonon lines (ZPLs) were
observed showing marked spectral diffusion. A clear effect due to the
substitution of hydrogen for deuterium in the solvent was discovered, visible
as significant reduction of spectral fluctuations. This suggests that proton
displacement is one of the main processes responsible for fine-tuning of site
energies in PS I. The occurrence of spectral jumps of ZPLs above 10 cm-1 in
absence of external excitation was proved to be highly unlikely at 1.4 K.
Consequently, at cryogenic temperatures proton tunneling in the vicinity of
the red pools is very unlikely without excitation. Even for far red-shifted
states of the PS I from all of the three above-mentioned species small Huang-
Rhys factors were found, implying only a weak coupling of the electronic
transition to the bath of vibrational modes. This finding indicates that no
distinct electron-phonon coupling is necessary for the strong redshift of
these states
Varying the morphology of silver nanoparticles results in differential toxicity against micro-organisms, HaCaT keratinocytes and affects skin deposition
The use of silver nanoparticles (Ag NPs) within the healthcare sector and consumer products is rapidly increasing. There are now a range of diverse-shaped Ag NPs that are commercially available and many of the products containing nanosilver are topically applied to human skin. Currently, there is limited data on the extent to which the antimicrobial efficacy and cytotoxicity of Ag NPs is related to their shape and how the shape of the Ag NPs affects their distribution in both intact and burn wounded human skin after topical application. In this study, we related the relative Ag NP cytotoxicity to potential skin pathogens and HaCaT keratinocytes in vitro with the shape of the Ag NPs. We employed multiphoton fluorescence lifetime imaging to map the distribution of the native and unlabeled Ag NPs after topical application to both intact and burn wounded human skin using the localized surface plasmon resonance signal of the Ag NPs. Truncated plate shaped Ag NPs led to the highest cytotoxicity against both bacteria (IC ranges from 31.25 to 125 ÎŒg/mL depending on the bacterial species) and HaCaT keratinocytes (IC 78.65 ÎŒg/mL [95%CI 63.88, 96.83]) thus both with similar orders of magnitude. All Ag NPs were less cytotoxic than solutions of silver nitrate (IC of 7.85 ÎŒg/mL [95%CI 1.49, 14.69]). Plate-shaped Ag NPs displayed the highest substantivity within the superficial layers of the stratum corneum when topically applied to intact skin and the highest deposition into the wound bed when applied to burned ex vivo human skin relative to other Ag NP shapes
Non-invasive metabolic imaging of melanoma progression
Skin cancer is associated with abnormal cellular metabolism which if identified early introduces the possibility of intervention to prevent its progress to a deadly metastatic stage. This study combines multiphoton microscopy with fluorescence lifetime imaging (FLIM) using a syngeneic melanoma mouse model, to detect changes in metabolic state of single epidermal cells as a metabolic marker to monitor the progress of tumor growth. This method utilizes imaging of the ratio of the amounts of the free and protein-bound forms of the intracellular autofluorescent metabolic co-enzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Here, we investigate the impact of the primary tumor lesion on the epidermal layers at three different growth stages of melanoma lesion compared to normal skin as a control. We showed a significant increase in the free-to-bound NADH ratio with the growth of the solid melanoma tumor, while concurrently the short and the long lifetime components of NADH remained constant. These results demonstrate the ability of FLIM for rapid, non-invasive and sensitive assessment of melanoma progression revealing its potential as a diagnostic tool for melanoma detection and as an aid for melanoma staging
Using multiphoton fluorescence lifetime imaging to characterize liver damage and fluorescein disposition in liver in vivo
Liver disease is the fifth most common cause of death and unlike many other major causes of mortality, liver disease rates are increasing rather than decreasing. There is no ideal measurement of liver disease and although biopsies are the gold standard, this only allows for a spot examination and cannot follow dynamic processes of the liver. Intravital imaging has the potential to extract detailed information over a larger sampling area continuously. The aim of this project was to investigate whether multiphoton and fluorescence lifetime imaging microscopy could detect early liver damage and to assess whether it could detect changes in metabolism of fluorescein in normal and diseased livers. Four experimental groups were used in this study: 1) control; 2) ischemia reperfusion injury; 3) steatosis and 4) steatosis with ischemia reperfusion injury. Results showed that multiphoton microscopy could visualize morphological changes such as decreased fluorescence of endogenous fluorophores and the presence of lipid droplets, characteristic of steatosis. Fluorescence lifetime imaging microscopy showed increase in NADPH in steatosis with and without ischemia reperfusion injury and could detect changes in metabolism of fluorescein to fluorescein monoglurcuronide, which was impaired in steatosis with ischemia reperfusion injury. These results concluded that the combination of multiphoton microscopy and fluorescence lifetime imaging is a promising method of assessing early stage liver damage and that it can be used to study changes in drug metabolism in the liver as an indication of liver disease and has the potential to replace the traditional static liver biopsy currently used
Revealing interaction of dyes and nanomaterials with organs by imaging
A key challenge in pharmacology and toxicology is understanding the exposure, fate and effects of drugs and nanomaterials on the body.Nanoparticles arewidely used in topically applied consumer products. For example, titanium dioxide and zinc oxide are used in commercial sunscreen formulations to afford the skin protection from harmful ultraviolet radiation. There are still ongoing safety concerns regarding the long-term toxicity and fate of nanomaterials within complex biological systems with a key question being whether topically applied nanoparticles can penetrate human skin and reach the viable epidermis to cause localized and potentially systemic toxicity under âin-useâ conditions. Recent advances in imaging technology have provided us with the tools to map the distribution of native, unlabeled, nanomaterials after application to biological tissue. Another key organ for in situ monitoring is the liver as it is the major site for drug metabolism and excretion in the body. Clearance of drugs from the body can be greatly altered in liver disease, resulting in toxicity and altered effects of the drugs. It is therefore crucial to understand liver functional changes in diseased livers. Recent advances in imaging technology have provided us with insight into mapping the distribution of native, unlabeled, nanomaterials after application to a range of organs within the body. This chapter deals with the use of multiphoton fluorescence microscopy in combination with fluorescence lifetime imaging techniques to assess the safety concerns regarding nanomaterials discussing the key challenges faced
Support for the safe use of zinc oxide nanoparticle sunscreens: lack of skin penetration or cellular toxicity after repeated application in volunteers
Zinc oxide is a widely used broad-spectrum sunscreen, but concerns have been raised about the safety of its nanoparticle (NP) form. We studied the safety of repeated application of agglomerated zinc oxide (ZnO) NPs applied to human volunteers over 5 days by assessing the skin penetration of intact ZnO-NPs and zinc ions and measuring local skin toxicity. Multiphoton tomography with fluorescence lifetime imaging microscopy was used to directly visualize ZnO-NP skin penetration and viable epidermal metabolic changes in human volunteers. The fate of ZnO-NPs was also characterized in excised human skin in vitro. ZnO-NPs accumulated on the skin surface and within the skin furrows but did not enter or cause cellular toxicity in the viable epidermis. Zinc ion concentrations in the viable epidermis of excised human skin were slightly elevated. In conclusion, repeated application of ZnO-NPs to the skin, as used in global sunscreen products, appears to be safe, with no evidence of ZnO-NP penetration into the viable epidermis nor toxicity in the underlying viable epidermis. It was associated with the release and penetration of zinc ions into the skin, but this did not appear to cause local toxicity