Modern techniques in detection, identification and quantification of bacteria and peptides from foods

Standards have been placed to regulate the microbial and preservative contents to assure that foods are safe to the consumer. In a case of a food-related disease outbreak, it is crucial to be able to detect and identify quickly and accurately the cause of the disease. In addition, for every day control of food microbial and preservative contents, the detection methods must be easily performed for numerous food samples. In this present study, quicker alternative methods were studied for identification of bacteria by DNA fingerprinting. A flow cytometry method was developed as an alternative to pulsed-field gel electrophoresis, the golden method . DNA fragment sizing by an ultrasensitive flow cytometer was able to discriminate species and strains in a reproducible and comparable manner to pulsed-field gel electrophoresis. This new method was hundreds times faster and 200,000 times more sensitive. Additionally, another DNA fingerprinting identification method was developed based on single-enzyme amplified fragment length polymorphism (SE-AFLP). This method allowed the differentiation of genera, species, and strains of pathogenic bacteria of Bacilli, Staphylococci, Yersinia, and Escherichia coli. These fingerprinting patterns obtained by SE-AFLP were simpler and easier to analyze than those by the traditional amplified fragment length polymorphism by double enzyme digestion. Nisin (E234) is added as a preservative to different types of foods, especially dairy products, around the world. Various detection methods exist for nisin, but they lack in sensitivity, speed or specificity. In this present study, a sensitive nisin-induced green fluorescent protein (GFPuv) bioassay was developed using the Lactococcus lactis two-component signal system NisRK and the nisin-inducible nisA promoter. The bioassay was extremely sensitive with detection limit of 10 pg/ml in culture supernatant. In addition, it was compatible for quantification from various food matrices, such as milk, salad dressings, processed cheese, liquid eggs, and canned tomatoes. Wine has good antimicrobial properties due to its alcohol concentration, low pH, and organic content and therefore often assumed to be microbially safe to consume. Another aim of this thesis was to study the microbiota of wines returned by customers complaining of food-poisoning symptoms. By partial 16S rRNA gene sequence analysis, ribotyping, and boar spermatozoa motility assay, it was identified that one of the wines contained a Bacillus simplex BAC91, which produced a heat-stable substance toxic to the mitochondria of sperm cells. The antibacterial activity of wine was tested on the vegetative cells and spores of B. simplex BAC91, B. cereus type strain ATCC 14579 and cereulide-producing B. cereus F4810/72. Although the vegetative cells and spores of B. simplex BAC91 were sensitive to the antimicrobial effects of wine, the spores of B. cereus strains ATCC 14579 and F4810/72 stayed viable for at least 4 months. According to these results, Bacillus spp., more specifically spores, can be a possible risk to the wine consumer.Mikrobien ja säilöntäaineiden määrälle elintarvikkeissa on luotu ja asetettu raja-arvoja, jotta voidaan varmistaa kuluttajien turvallisuus. Erityisesti ruokamyrkytysepidemioissa on oleellista, että taudinaiheuttajat voidaan havaita ja tunnistaa mahdollisimman nopeasti ja tarkasti. Tämän lisäksi päivittäisessä mikrobien ja säilöntäaineiden seurannassa ja kontrolloinnissa käytettävien ilmaisutekniikoiden ja metodologioiden tulee olla helppokäyttöisiä. Tässä väitöskirjassa tutkittiin vaihtoehtoisia nopeampia mittausmenetelmiä bakteerien tunnistamiseen DNA-sormenjälkien avulla. Työssä kehitettiin virtaussytometriin perustuva menetelmä vaihtoehdoksi pulssikenttägeelielektroforeesille ( the golden method ). DNA-palojen koon mittaaminen erittäin herkällä virtaussytometrillä mahdollisti lajien ja kantojen erottamisen toistettavalla ja vertailtavissa olevalla tavalla pulssikenttägeelielektroforeesiin nähden. Uusi menetelmä oli satoja kertoja nopeampi ja 200,000 kertaa herkempi kuin vertailumenetelmä. Tämän lisäksi kehitettiin myös toinen DNA-sormenjälkitunnistusmenetelmä. Menetelmässä bakteerin DNA:ta pilkotaan yhdellä entsyymillä ja syntyneitä DNA-paloja monistetaan erityisillä alukkeilla, jolloin syntyy kullekin bakteerille tunnusomainen sormenjälkikuvio. Tämä menetelmä mahdollisti patogeenibakteerien: Bacilli, Staphylococci, Yersinia, ja Escherichia coli sukujen, lajien ja kantojen erottamisen. Uudella menetelmällä sormenjälkikuviot olivat myös yksinkertaisempia ja helpompia analysoida kuin perinteisellä menetelmällä, jossa käytetään kahta entsyymiä. Nisiiniä (E234) käytetään yleisesti säilöntäaineena erilaisissa elintarvikkeissa ja erityisesti maitotuotteissa ympäri maailmaa. Nisiinin määrittämiseen on olemassa erilaisia mittausmenetelmiä, mutta ne eivät ole yleensä tarpeeksi herkkiä, spesifisiä ja nopeita. Tässä tutkimuksessa kehitettiin testi, jossa näytteen sisältämä nisiini osoitetaan reportterigeenin avulla. Testissä käytettiin Lactococcus lactis kanta, jolla on kromosomissa kaksikomponenttisignaalijärjestelmä NisRK ja plasmidissa nisA-promoottori gfpuv reportterigeenin edessä. Nisiini aktivoi nisA-promoottorin NisRK-komponentin välituksellä, mikä saa aikaan reportterigeenin ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFPuv) ilmentymisen, joka voidaan mitata. Testi oli erittäin herkkä ja sillä pystyttiin havaitsemaan jopa 10 pg/ml nisiinipitoisuus kasvatusliemessä. Tämän lisäksi se oli sovellettavissa mittauksiin erilaisista elintarvikkeista, kuten maidosta, salaattikastikkeista, prosessoiduista juustoista, nestemäisistä kananmunista ja säilyketomaatista. Alkoholipitoisuus, alhainen pH-taso ja orgaanisen aineen pitoisuus antavat viinille hyvät antimikrobiset ominaisuudet, minkä vuoksi viiniä pidetään yleisesti mikrobien suhteen turvallisena elintarvikkeena. Tämän väitöskirjan yhtenä tavoitteena oli tutkia asiakkaiden palauttamia viinejä, joiden oletettiin olleen syynä ruokamyrkytysoireisiin. Osittaisen 16S rRNA geenisekvenssin analysoinnin, ribotyypityksen ja sian siittiöiden liikkuvuuskokeen avulla yhdestä viinistä löydettiin ja tunnistettiin Bacillus simplex BAC91 bakteeri, joka tuotti siittiösolujen mitokondrioihin vaikuttavaa myrkkyä. Viinin antimikrobinen aktiviteetti mitattiin B. simplex BAC91, B. cereus ATCC 14579 (tyyppikanta) ja kereulidi-myrkkyä tuottavan B. cereus F4810/72 bakteerien vegetatiivisilla soluilla ja itiöillä. Vaikka B. simplex BAC91 bakteerin vegetatiiviset solut ja itiöt olivat herkkiä viinin antimikrobisille ominaisuuksille, B. cereus tyyppikanta ATCC 14579 ja B. cereus F4810/72 -bakteereiden itiöt pysyivät elossa ainakin neljän kuukauden ajan. Tulosten perusteella Bacillus spp. ja erityisesti niiden itiöt voivat olla mahdollinen riski viinin kuluttajille

Phylogenetic inference of Coxiella burnetii by 16S rRNA gene sequencing.

Coxiella burnetii is a human pathogen that causes the serious zoonotic disease Q fever. It is ubiquitous in the environment and due to its wide host range, long-range dispersal potential and classification as a bioterrorism agent, this microorganism is considered an HHS Select Agent. In the event of an outbreak or intentional release, laboratory strain typing methods can contribute to epidemiological investigations, law enforcement investigation and the public health response by providing critical information about the relatedness between C. burnetii isolates collected from different sources. Laboratory cultivation of C. burnetii is both time-consuming and challenging. Availability of strain collections is often limited and while several strain typing methods have been described over the years, a true gold-standard method is still elusive. Building upon epidemiological knowledge from limited, historical strain collections and typing data is essential to more accurately infer C. burnetii phylogeny. Harmonization of auspicious high-resolution laboratory typing techniques is critical to support epidemiological and law enforcement investigation. The single nucleotide polymorphism (SNP) -based genotyping approach offers simplicity, rapidity and robustness. Herein, we demonstrate SNPs identified within 16S rRNA gene sequences can differentiate C. burnetii strains. Using this method, 55 isolates were assigned to six groups based on six polymorphisms. These 16S rRNA SNP-based genotyping results were largely congruent with those obtained by analyzing restriction-endonuclease (RE)-digested DNA separated by SDS-PAGE and by the high-resolution approach based on SNPs within multispacer sequence typing (MST) loci. The SNPs identified within the 16S rRNA gene can be used as targets for the development of additional SNP-based genotyping assays for C. burnetii

55 <i>Coxiella burnetii</i> strains used in this study and SNPs within their respective 16S rRNA genes.

<p>55 <i>Coxiella burnetii</i> strains used in this study and SNPs within their respective 16S rRNA genes.</p

Comparison of typing methods.

<p>Comparison of typing methods.</p

MST loci SNP-based phylogeny of <i>C</i>. <i>burnetii</i>.

<p>This rooted phylogenetic tree was created from pairwise distances observed from 14 SNP sites within MST loci. SNP positions in <i>C</i>. <i>burnetii</i> Nine Mile (bold) are outlined in Hornstra <i>et al</i>. [<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0189910#pone.0189910.ref019" target="_blank">19</a>]. The predicted genomic groups from this phylogenetic analysis are circled in blue and the 16S rRNA gene-based groups are color coded for comparison.</p

Insertion polymorphism identified in the 16S rRNA gene of <i>C</i>. <i>burnetii</i> Mauriet.

<p>(A) DNA sequences obtained using primers E8F and E341R designate an adenine insertion at nucleotide position 213 which is confirmed in the electropherograms generated by Sequencher™ analysis software. (B) Sequence alignment shows 16S rRNA genes of <i>C</i>. <i>burnetii</i> Z3055 (GenBank accession number NZ_LK937696) and 3262 (GenBank accession number CP013667) also possess this insertion which is absent in the Nine Mile reference (Ref) strain sequence.</p

16S rRNA gene SNP-based phylogeny of <i>C</i>. <i>burnetii</i>.

<p>This rooted phylogenetic tree was created from pairwise distances observed from 16S rRNA gene SNP sites. The five SNPs and one insertion identified among the 55 16S rRNA gene sequences gave rise to six groups (color coded). Based on sequence alignment to the 16S rRNA gene of <i>C</i>. <i>burnetii</i> Nine Mile (bold), SNPs at positions 64, 164, 622, 830, and 1022 and an insertion at positon 213 (in parentheses) gave rise to the six distinct SNP signatures, which are displayed on their respective branches.</p