A hőmérséklet hatása a növényi RNS interferencia hatékonyságára = The effect of temperature on RNA interference in higher plants

A hőmérséklet hatása a növényi RNS interferencia hatékonyságára Programunk célja a növényi RNS interferencia (RNAi) rendszer hőmérsékletfüggésének vizsgálata volt. Igazoltuk, hogy a növényi RNAi rendszer egyes útvonalai erősen hőmérsékletfüggőek, így pl. a transzgén-, illetve vírus-indukálta RNAi válaszok alacsony hőmérsékleten alig működnek, míg normál hőmérsékleten ezek a rendszerek igen aktívak. Kimutattuk, hogy a transzgénekről, illetve vírusokról származó, az RNAi rendszer által generált rövid RNS-ek (siRNS-ek) szintje a hőmérséklet emelésével gyorsan nő. Ismert, hogy a növény-vírus kapcsolatok jelentős részében a tünetek alacsony hőmérsékleten erősek, míg magas hőmérsékleten gyengék. Igazoltuk, hogy ennek oka az, hogy a vírus-indukálta RNAi rendszer -a növények leghatékonyabb antivirális rendszere- hidegben alig működik, így a tünetek felerősödnek, a víruskártétel jelentős. Ugyanakkor melegben a hatékony RNAi rendszer tünetcsökkenéshez, vírusellenállósághoz vezet. A transzgénikus növények jelentős részénél a transzgénikus fenotípus a transzgén-indukálta RNAi rendszeren alapszik. Bizonyítottuk, hogy alacsony hőmérsékleten a transzgén-indukálta RNAi rendszeren alapuló transzgénikus fenotípusok, pl antiszensz gátlás, vírusellenállóság, elveszhetnek. Kimutattuk azt is, hogy megfelelő transzgén konstrukciók (fordított ismétlődést tartalmazó konstrukciók) használatával ez a veszély csökkenthető, azaz a transzgénikus fenotípusok alacsony hőmérsékleten is stabilak maradnak. | The effect of temperature on RNA interference in higher plants The aim of our project was to study the effect of temperature on efficiency of RNA interference (RNAi) system of higher plants. We have shown that certain plant RNAi pathways, as transgene- or virus- induced RNAi pathways are inhibited at low temperature, while these patways work efficiently at normal temperature. Indeed, the levels of RNAi generated transgene or virus derived short RNAs (siRNAs) are dramatically reduced at low temperature. Previously, it has been reported that in cold, viral infections of plants lead to strong symptoms and that outbreaks of viral diseases are frequent. By contrast, at high temperature the symptoms are masked, plants recover quickly. We show that viral symptoms are strong in cold because virus induced plant RNAi (the most important antiviral sytem of plants) is inefficient, whereas at high temperature the efficient RNAi can protect plants. Transgenic phenotypes of many transgenic plants are depend on transgene induced RNAi. We have demonstrated that in cold, transgenic phenotypes -as antisense inactivation or virus resistance- that depend on trangene induced RNAi are dramatically weakened. Importantly, if inverted repeat containing constructs are used, trangenic phenotypes are stable even at low temperature

Növényvírusok replikációjában, a tünet kialakulásában és a növény védekezési rendszerében szerepet játszó gazdagének azonosítása és vizsgálata = Identification and analyses of altered patterns of gene expression in compatible host elicited by plant virus infection

Az poszt-transzkripcionális gén csendesítés (PTGS) egy hatékony antivirális védekezési rendszer növényekben. Adataink azt mutatták, hogy amíg a vad típusú vírus (CymRSV) az egész növényt megfertőzi addig a p19 (a vírus PTGS szuppresszor fehérjéje) deficiens vírus felhalmozódása csak az erekre és azok környékére korlátozódik. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a p19 képes megakadályozni a PTGS mobil szignál által kiváltott aktiválódását a fertőzési front előtt, előidézve a növény általános fertőzöttségét. Továbbiakban, azonosítottuk a PTGS alapvető szerepét a DI RNS mediálta tünet csökkentésben. Adataink megmutatták a PTGS asszociált 21nt siRNS-sek szerepét a szisztemikus szignalizációs eseményekben. Azonosítottuk a DI RNS-ek 5' végi szakaszát mint a tünet módosításban szerepet játszó legfontosabb régiót. Létrehoztunk egy Arabidopsis protoplaszton alapuló szinkronizált infekciós rendszert és azonosítottunk egy endogén gént, amely teljes "shut off"-t mutat vírus fertőzött növényben. Módisított LNA oligonukleotidok felhasználásával létrehoztunk egy olyan érzékeny kis RNS detektálási rendszert, amely lehetővé teszi a vírus ertőzésben szerepet játszó miRNS-ek kimutatását mind northern blot analízissel mind in situ hibridizációval. | In plants post-transcriptional gene silencing (PTGS) is an ancient and effective defense mechanism against virus infection. We showed that in contrast to the uniform accumulation of CymRSV throughout systemically infected leaves, the presence of p19 (PTGS suppressor of the virus) deficient virus was confined to and around the vascular bundles. These results suggest that the role of p19 is to prevent the onset of mobile signal induced systemic PTGS ahead the virus infection front leading to generalized infection. We also showed that the activation of PTGS plays a pivotal role in DI RNA-mediated interference. Our data identified the pivotal role of 21 nt siRNAs in PTGS signaling. In addition we identified a 5' proximal sequence element of DI RNAs as the most important symptom determinant region. We established a Arabidopsis protoplast based synchronized infection system and identified an endogenous gene showing complete shut off in virus infected plants. Moreover, we enhanced the sensitivity of detecting mature microRNAs by LNA modified oligonucleotides probes, which may open the way of northern blot and in situ detection of miRNAs playing important in symptom development

Poszt-transzkripcionális géncsendesítés és szupresszió molekuláris mechanizmusának feltárása növényekben = Unraveling the mechanism of Post-transcriptional gene silencing and suppression in plants

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik, és magába foglalja az állati RNS interferencia és a növényi poszt-ranszkripcionális géncsendesítés (PTGS) jelenségét. A növényekben a PTGS mint antivirális mechanizmus is működik. Kutatásaink folyamán feltártuk, hogy a vírus RNS erős másodlagos szerkezettel bíró részei aktiválják a PTGS alapú antivirális mechanizmust oly módon, hogy a DICER nevezetű RNAse III típusú enzim kis 21-26 nukleotid hosszú RNS molekulákká, ún. siRNS-ekké darabolják a másodlagos szerkezettel bíró vírus RNS szakaszokat. A vírus fertőzte növényekben felhalmozódó siRNS-ek beépülnek a PTGS másik effector komplexebe a RISC-be amely vírus specfikus siRNS-ek miatt specifikusan gátolja a vírus RNS kifejeződését. Igazoltuk, hogy ez a gátlás a vírus genom specifikus vágásával megy végbe. A vírusok az evolúció során silencing szupresszor fehérjék termelésével válaszoltak a növények antivirális reakciójára. Laboratóriumunkban a világon először sikerült feltárnunk egy ilyen silencing szupresszor fehérje (Cymbidium ringspot vírus kódolta p19 fehérje) kristályszerkezetét és molekuláris működését. Megállapítottuk, hogy a p19 szupresszor fehérje a siRNS-ek megkötésével gátolja az antivirális RISC felépülését, így a PTGS alapú antivirális választ. Igazoltuk továbbá, hogy ez a molekuláris mechanizmus altalánosan elterjedt a növényi vírus kódolta silencing szupresszor fehérjék működésében. | RNA silencing is conserved in a broad range of eukaryotes and includes the phenomena of RNA interference in animals and posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants. In higher plants, PTGS acts as an antiviral system, and we have explored that antiviral PTGS is induced by viral dsRNAs or structured single-stranded RNAs (ssRNAs) that are processed into small interfering RNAs (siRNAs) by RNase III-like enzymes such as DICER. These virus specific siRNAs than guide the sequences pecific degradation of target viral RNAs by the RNA-induced silencing complex (RISC). We also showed that antiviral RISC, which programmed by the virus specific siRNAs mediates the cleavage of a target viral RNA when there is perfect or nearly perfect base pairing between the target. To counteract an antiviral RNA silencing response, plant viruses evolved and express silencing suppressor proteins. At the first time we explored the structure and molecular bases of a silencing suppressor protein. We have shown that the 19 kDa protein (p19) of Cymbidium ringspot virus is a systemic silencing suppressor that prevents the assembly of antiviral RISC complexis by binding and sequestering of siRNAs, thus inhibiting the PTGS based antiviral response. Moreover we also confirmed that sequestering of siRNA is a common strategy of silencing suppressor proteins, encoded by plant viruses

Ecotype-specific blockage of tasiARF production by two different RNA viruses in Arabidopsis

Arabidopsis thaliana is one of the most studied model organisms of plant biology with hundreds of geographical variants called ecotypes. One might expect that this enormous genetic variety could result in a differential response to pathogens. Indeed, we observed previously that the Bur ecotype develops much more severe symptoms (upward curling leaves and wavy leaf margins) upon infection with two positive strand RNA viruses of different families (turnip vein-clearing virus, TVCV, and turnip mosaic virus, TuMV). To find the genes potentially responsible for the ecotype- specific response, we performed a differential expression analysis of the mRNA and sRNA pools of TVCV and TuMV-infected Bur and Col plants along with the corresponding mock controls. We focused on the genes and sRNAs that showed an induced or reduced expression selectively in the Bur virus samples in both virus series. We found that the two ecotypes respond to the viral infection differently, yet both viruses selectively block the production of the TAS3 derived small RNA specimen called tasiARF only in the virus-infected Bur plants. The tasiARF normally forms a gradient through the adaxial and abaxial part of the leaf (being more abundant in the adaxial part) and post-transcriptionally regulates ARF4, a major leaf polarity determinant in plants. The lack of tasiARF-mediated silencing could lead to an ectopically expressed ARF4 in the adaxial part of the leaf where the misregulation of auxin-dependent signaling would result in an irregular growth of the leaf blade manifesting as upward curling leaf and wavy leaf margin. QTL mapping using Recombinant Inbred Lines (RILs) suggests that the observed symptoms are the result of a multigenic interaction that allows the symptoms to develop only in the Bur ecotype. The particular nature of genetic differences leading to the ecotype-specific symptoms remains obscure and needs further study

Genome-Wide Identification of RNA Silencing-Related Genes and Their Expressional Analysis in Response to Heat Stress in Barley (Hordeum vulgare L.)

Barley (Hordeum vulgare L.) is an economically important crop cultivated in temperate climates all over the world. Adverse environmental factors negatively affect its survival and productivity. RNA silencing is a conserved pathway involved in the regulation of growth, development and stress responses. The key components of RNA silencing are the Dicer-like proteins (DCLs), Argonautes (AGOs) and RNA-dependent RNA polymerases (RDRs). Despite its economic importance, there is no available comprehensive report on barley RNA silencing machinery and its regulation. In this study, we in silico identified five DCL (HvDCL), eleven AGO (HvAGO) and seven RDR (HvRDR) genes in the barley genome. Genomic localization, phylogenetic analysis, domain organization and functional/catalytic motif identification were also performed. To understand the regulation of RNA silencing, we experimentally analysed the transcriptional changes in response to moderate, persistent or gradient heat stress treatments: transcriptional accumulation of siRNA- but not miRNA-based silencing factor was consistently detected. These results suggest that RNA silencing is dynamically regulated and may be involved in the coordination of development and environmental adaptation in barley. In summary, our work provides information about barley RNA silencing components and will be a ground for the selection of candidate factors and in-depth functional/mechanistic analyses

Az RNS silencing szerepe, mechanizmusa a vírus gazda kölcsönhatásban = The role and the mechanism of RNA silencing in the plant virus interplay

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik. Kutatásaink során feltártuk a Cymbidium ringspot vírus genomról kéződő small interferáló (si) RNS eredetét nagy hatékonyságú 454 (Life Science) és Soplexa (illumina) szekvenaló rendszerek alkalmazásával. A vírus genomról származó kis RNS-eket rátérképeztük a vírus genomjára, amely alapján "forró pontokat" tudtunk azonosítani. Igazoltuk,hogy virus siRNS-ek túlnyomó töbsége a virus pozitív száláról származik, és 21-22 nukleotid (nt) hosszú. Megállapítottuk, hogy vírus siRNS-ekkel töltött RISC (RNA Induced Silencing Complex) komplexek szekvenciaspecifikusan hasítják a vírus genomot. Számos silencing szupresszor fehérje (p19, HC-Pro, és p122) részletes analízisével igazoltuk, hogy a növény antivirális válaszát, a vírus kódolta silencing szupresszorok hatékonyan gátolják. Bizonyítottuk, hogy a siRNS-ek specifikus kötése és inaktiválása a legelterjedtebb stratégia a silencing szupresszor fehérjék között. Feltártuk, hogy a silencing szuppresszor fehérjék egy jelentős csoportja gátolja növények endogén siRNS és miRNS biogenezisét. A silencing szupressor feherjék interakciója az endogen silencing útvonalakkal feltehetően a magyarázata a vírus okozta tünetek kialakulásának, hiszen a szupresszor fehérjék súlyosan zavarja növény egyedfejlődését. | RNA silencing is a gene inactivation mechanism, which is conserved in a broad range of eukaryotes. The central players in RNA-mediated gene silencing are the small 21-24 nucleotide long RNA molecules engaged in sequence-specific interactions to inhibit gene expression. RNA silencing fulfils fundamental regulatory roles, as well as antiviral functions. We profiled viral siRNAs using two different high-throughput sequencing platforms. Both deep sequencing techniques revealed a strong bias in viral siRNAs for the positive strand of the virus and identified regions on the viral genome that produced viral siRNA in much higher abundance than other regions. We also analysed the viral RNA targeting by virus induced gene silencing in tombusvirus infected plants, and we show evidence that antiviral response is based on viral RNA cleavage by RNA-induced silencing effector complex (RISC) programmed by virus-specific siRNAs.. To counteract RNA silencing, viruses express silencing suppressors that interfere with both siRNA- and microRNA-guided silencing pathways. We used comparative approaches to analyse the molecular mechanism of suppression by three well-studied silencing suppressors. We found that silencing suppressors p19, p21 and HC-Pro each inhibit the RISC assembly. We demonstrated that these suppressors are able to interact with the endogenous silencing pathways suggesting that these interactions have an important role in the development of virus-induced symptoms