Ioncsatornák szerepe az immunrendszer sejtjeinek differenciálódásában és proliferációjában = The role of ion channels in differentiation and proliferation of immune cells.

Elektrofiziológiai és biokémiai módszerek kombinálásával számos új, potenciálisan immunszuppresszív hatású Kv1.3 ioncsatorna blokkoló toxint fedeztünk fel, melyeket a az Anurotonus phaiodactylus, a Centruroides elegans Thorell, a Centruroides suffusus suffusus és a Tityus stigmurus skorpiók mérgéből izoláltunk. Kimutattuk, hogy a Kv1.3 ioncsatorna inaktiváció lassulásában döntő szerepet játszik a 399-es pozícióban található hisztidin protonálódása, mely elektrosztatikus kölcsönhatáson keresztül fokozza az inaktiváció sebességét meghatározó K+ kötőhely betöltöttségét. Valószínűsítettük, hogy a Shaker K+ csatorna esetében az aktivációs és inaktivációs kapu közötti csatolás alapvető tényező a sejtmembránon átáramló ionfluxus szabályozásában. Kísérletes eredményeink szerint a Kv1.3 ioncsatornák eloszlása a plazmamembránban nem véletlenszerű, karakterisztikus mintázatot mutat. Citotoxikus és target sejt konjugátumok vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a Kv1.3 csatornák a két sejt által képzett immunológiai szinapszisba (IS) rendeződnek át, a csatornák polarizált expressziót mutatnak. A sejtfelszíni molekulák eloszlásának és távolságának kvantitatív jellemzésére új biofizikai és számítógépes eljárásokat dolgoztunk ki. Farmakológiai és biofizikai módszerekkel sikerült alátámasztanunk, hogy az éretlen dendritikus sejtek NaV1.7 nátrium, míg az érettek Kv1.3 kálium ioncsatornát fejeznek ki. | Combination of electrophysiological and biochemical approaches resulted in the identification and characterization of several new Kv1.3 blocker peptide toxins with potential immunesuppressive effect from the venoms of Anurotonus phaiodactylus, Centruroides elegans Thorell, Centruroides suffusus suffusus and Tityus stigmurus scorpions. It has been shown that protonation of His399 plays a dominant role in the regulation of the kinetics of slow inactivation of Kv1.3, suggesting a model in which the protonated histidines influence the occupancy of the K+ binding site determining the rate of inactivation. We suggest that coupling between the activation and inactivation gates of Shaker K+ channels is a fundamental factor in the regulation of the transmembrane ion flux. We showed that the surface distribution of Kv1.3 ion channels in the plasma membrane of T cells is nonrandom.. Kv1.3 channels were recruited into the immunological synapse formed between cytotoxic and target cells thereby showing a polarized channel expression. For the numerical characterization of membrane protein distributions and distances we developed new biophysical and computer methods. A combination of pharmacological, biophysical and molecular biological methods showed NaV1.7 sodium and Kv1.3 ion channel expression in the immature and mature dendritic cells, respectively

Multiple Binding Sites for Melatonin on Kv1.3

AbstractMelatonin is a small amino acid derivative hormone of the pineal gland. Melatonin quickly and reversibly blocked Kv1.3 channels, the predominant voltage-gated potassium channel in human T-lymphocytes, acting from the extracellular side. The block did not show state or voltage dependence and was associated with an increased inactivation rate of the current. A half-blocking concentration of 1.5mM was obtained from the reduction of the peak current. We explored several models to describe the stoichiometry of melatonin-Kv1.3 interaction considering one or four independent binding sites per channel. The model in which the occupancy of one of four binding sites by melatonin is sufficient to block the channels gives the best fit to the dose-response relationship, although all four binding sites can be occupied by the drug. The dissociation constant for the individual binding sites is 8.11mM. Parallel application of charybdotoxin and melatonin showed that both compounds can simultaneously bind to the channels, thereby localizing the melatonin binding site out of the pore region. However, binding of tetraethylammonium to its receptor decreases the melatonin affinity, and vice versa. Thus, the occupancy of the two separate receptor sites allosterically modulates each other

The Kv1.3 K+ channel in the immune system and its “precision pharmacology” using peptide toxins

Since the discovery of the Kv1.3 voltage-gated K+ channel in human T cells in 1984, ion channels are considered crucial elements of the signal transduction machinery in the immune system. Our knowledge about Kv1.3 and its inhibitors is outstanding, motivated by their potential application in autoimmune diseases mediated by Kv1.3 overexpressing effector memory T cells (e.g., Multiple Sclerosis). High affinity Kv1.3 inhibitors are either small organic molecules (e.g., Pap-1) or peptides isolated from venomous animals. To date, the highest affinity Kv1.3 inhibitors with the best Kv1.3 selectivity are the engineered analogues of the sea anemone peptide ShK (e.g., ShK-186), the engineered scorpion toxin HsTx1[R14A] and the natural scorpion toxin Vm24. These peptides inhibit Kv1.3 in picomolar concentrations and are several thousand-fold selective for Kv1.3 over other biologically critical ion channels. Despite the significant progress in the field of Kv1.3 molecular pharmacology several progressive questions remain to be elucidated and discussed here. These include the conjugation of the peptides to carriers to increase the residency time of the peptides in the circulation (e.g., PEGylation and engineering the peptides into antibodies), use of rational drug design to create novel peptide inhibitors and understanding the potential off-target effects of Kv1.3 inhibition

K+ csatornák és a T sejt receptor jelátvitelének kapcsolata = Relationship between K+ channels and T cell receptor signaling

A T limfociták aktivációjának szabályzásában a feszültség-kapuzott Kv1.3 K+ csatornák központi szerepet játszanak. A pályázat megvalósítása a során kimutattuk, hogy a Kv1.3 csatornák immunológiai szinapszisba (IS) történő átrendeződése az IS funkciójának és a csatornák aktivitásának kölcsönös szabályozási lehetőségét jelentik. E kölcsönös kapcsolat elemei közül kiemelendő, hogy a Kv1.3 csatornák kapuzási kinetikájának jelentős változását mutattuk ki a sejtmembrán lipid összetételének változása ill. a csatornák IS-be történő akkumulációja során. A csatornák IS-beli akkumulációja a T sejt membránpotenciál szabályozásának egy új formáját, a membránpotenciál oszcillációját okozta, mely Kv1.3 gátlószerekkel modulálható volt. E kísérletekhez szorosan kapcsolódott a nagy affinitású és szelektivitású Kv1.3 gátlószerek azonosítása és jellemzése. Leírtunk öt új Kv1.3 gátló skorpió toxint [?-KTx2.8 (Ce1), ?-KTx2.9 (Ce2), ?-KTx2.11 (Ce4), ?- KTx2.13 (Css20) és ?- KTx4.6 (Tst26)], és meghatároztuk azokat a kritikus aminosavakat melyek a toxinok Kv1.3 és Kv1.2 csatornák közötti szelektivitásáért felelősek. Kísérleteink során olyan egyedülálló módszert dolgoztunk ki, mely alkalmas olyan kis-molekula gátlószerek azonosítására, melyek szelektíven kötődnek a csatornák inaktivált állapotához. A kutatómunka során kapott eredmények közelebb vittek a Kv1.3 csatornák élettani funkciójának megértéséhez ill. terápiásan alkalmazható immunoszuppresszív peptidek előállításához. | Voltage-gated Kv1.3 channels play a distinguished role in regulation of T cell activation. During the research program we showed that recruitment of Kv1.3 channels into the immunological synapse (IS) results in the reciprocal regulation of the function of the IS and the activity of Kv1.3 channels. Among several aspects of this regulation we showed that the gating kinetics of Kv1.3 channels is significantly altered upon recruitment of the channels in to the IS and that the kinetics is sensitive to the lipid composition of the plasma membrane. Recruitment of Kv1.3 into the IS allows a novel type of the membrane potential regulation in T cells by periodic membrane potential oscillations, which was sensitive to Kv1.3 inhibitors. These results motivated the search for novel high affinity and selectivity Kv1.3 inhibitors. We have described five Kv1.3 inhibitor scorpion toxins [?-KTx2.8 (Ce1), ?-KTx2.9 (Ce2), ?-KTx2.11 (Ce4), ?- KTx2.13 (Css20) and ?- KTx4.6 (Tst26)], and determined critical amino acid residues responsible for the selectivity between Kv1.3 and Kv1.2 channels. We have also developed a unique method for studying K+ channels blockers having selective affinity for the inactivated channels. Results obtained during the completion of the research program led to a better understanding of the physiological role of Kv1.3 channels in T cells and to the generation therapeutic immunosuppressor peptides

Periodic Membrane Potential and Ca2+ Oscillations in T Cells Forming an Immune Synapse

L